PCR仪温度准确性影响的研究

　　使用不同基因片段，包括：新冠假病毒片段、转基因玉米MON863基因片段，细菌毒力基因片段等开展了温度偏差影响的研究。研究中使用的设备涉及：7500FAST定量PCR仪(ABI公司、CFX96™ Real-Time System（BIO-RAD公司）、Roche 480（罗氏公司）等。研究中使用含以上基因片段的标准品或质控品，按照日常检测的标准方法或技术规范给出的PCR扩增程序进行目标片段的扩增。

　　研究中人为将程序中规定的温度调高或调低1°C、2°C、3°C、5°C等，模拟反应池温度与规定值有偏差的反应条件，探索其对扩增结果和Cт值影响。试验结果显示，当实验研究使用的模版浓度较高时，温度偏差对PCR扩增效果的影响不明显。但使用中低浓度模板时，温度偏差对PCR扩增效果有影响。

　　例如，在低浓度样品浓度的试验研究中，使用含转基因玉米MON863基因片段的标准品，即将MON863质粒DNA采用10倍梯度稀释至浓度为0.8 copies/μL，此时测定的标准曲线R2为0.999，扩增效率为104%，说明该标准曲线具有良好的线性关系，因此，选取该浓度水平作为低浓度测试水平。以此为弱阳性样品，按照《SN/T 1196-2018 转基因成分检测玉米检测方法》的规定的扩增程序进行实时荧光PCR检测，对不同温度偏差下的CT进行汇总和统计分析后，结果显示：对于AB 7500仪器而言，当反应程序整体温度调高1℃、整体温度降低1℃、时，AB 7500仪器检测弱阳性样本CT值存在差异，说明当AB 7500仪器温度变化时，弱阳性样本检测CT值受到影响。标准程序温度整体调高1℃至调低1℃，弱阳性样本均检出，检出率和结果判定未受到影响，但是弱阳性样本检测CT值受到影响，说明弱阳性样本的拷贝数在一定范围内时，AB7500仪器的温度整体变化后检出率不受影响，但是当弱阳性样本的拷贝数降低到某个的临界值时，AB7500仪器的温度整体变化后，弱阳性样本的检出率将会受到影响。

　　使用CFX96™ Real-Time System进行的实验结果，与上述结论类似。采用其他片段（新冠病毒基因片段、细菌StxI基因片段）和仪器（Roche 480）试验后，对于中低浓度模板的实验结果也呈现上述趋势。但对于双链DNA的扩增，在引物和酶充足的情况下，对温度的需求比较宽泛，尤其是当扩增中涉及的温度点比较少，控温时间短的反应条件，对温度的影响不敏感。