最杰出的等温扩增方法之一——解旋酶依赖性扩增HDA

解旋酶依赖性扩增技术（helicase-dependent amplification，HDA）于2004年发明，是模拟动物体内DNA的复制机制的一种体外恒温基因扩增技术。随着技术的发展，在反应速度、特异性和灵敏度上也不断被提升，至少有三代HAD技术，整个系统比较简单，高效。

系统核心组成：

• 解旋酶，helicase

  -利用ATP水解提供的能量来解开双链DNA核苷酸配对形成的氢键，从而形成单链DNA；

  -常用解旋酶：大肠杆菌的UvrD和T7噬菌体的gp4；

• 单链结合蛋白，single strand binding protein，SSB

  -SSB可以动态的结合并脱离单链DNA，防止新形成的单链DNA重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解的蛋白质。

  -常用的SSB：T4噬菌体的gp32，RB49噬菌体的gp32；

• DNA聚合酶，DNA polymerase

  -以DNA为模板，利用dNTP合成子代DNA；

  -常用的DNA聚合酶：Bst聚合酶，或者Klenow聚合酶等。
  

• 其他

  -MutL：主要负责错配修复，招募UvrD解旋酶来解开包含复制错误的DNA链。所以，MutL可以负载UvrD到DNA上从而激活其解旋酶活性。

  -Helimerase：通过基因工程的方法，将UvrD和Bst聚合酶的功能亚基进行拼接，形成具有双功能蛋白，同时具有解旋酶和聚合酶的功能。

表：三代HAD核心蛋白原料的异同点

反应原理：

1、（MutL辅助）解旋酶将双链核酸解旋，产生部分单链的序列；

2、SSB动态平衡结合到新形成的单链上，引物与单链区结合；

3、在DNA聚合酶的作用下形成新的双链DNA。

HAD的原理图

系统继续提升空间：

1、筛选高效解旋酶

HAD扩增方法受DNA解旋酶解旋速度和延伸长度的影响很大，所以筛选更高效的解旋酶会更大程度的缩短反应时间；

2、解旋酶和聚合酶协同工作

开发或者寻找自然界中协同工作的解旋酶和聚合酶，尽可能平衡解旋酶和聚合酶的反应速度，防止解旋酶取代聚合酶。因为解旋酶解链反应是反应系统的限速步骤，所以要确保一旦解链，尽可能有效的完成新链的合成。