单靶标or多靶标：新冠检测试剂该如何选择？

检测性能评价中最主要的就是灵敏度与特异性。PCR扩增产物以指数方式增加，理论上2-3小时即可将1个靶分子DNA扩增至10亿个，因而具有很高的灵敏度。而影响特异性的因素通常有：引物的特异性、碱基配对的正确性以及靶标基因的特异性与保守性。

我们注意到，以上所提到的PCR试剂的灵敏度与特异性都离不开一个叫做“靶标基因”的东西。那什么是“靶标基因”呢？

靶标基因也叫目的基因，是PCR实验中所要研究的特定基因片段，检测试剂盒中的引物与荧光探针会与靶标基因发生特异性结合。就此次的新冠病毒而言，由于其与其他病毒如SARS/MERS等具有同源性，如果选择的靶标基因特异性不足，那么可能会导至假阳性结果。因此，选择正确且合适的病毒靶标进行引物与探针的设计格外重要，直接影响到试剂的检测性能。

结合以上内容我们可以看出，合适的靶标基因应具有强特异性和高保守性。

在病毒序列公布后，国家卫健委印发的最新版《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》，推荐选用针对新型冠状病毒的ORF1ab、N基因区域的引物和探针。

国际上以《加拿大安大略省公共卫生局（PHO）实验室的指导文件》为例，扩增靶基因包括RdRp基因（ORF1ab基因中的一段）和E基因。

另外以上两份文件都有说明，在实验室要确认一个病例为阳性，需用实时RT-PCR方法至少检测到病毒两个靶基因（国内添加了对于单个靶标阳性的判读，若复检仍为阳性则可判读为阳性）。

比较分析《全国新型冠状病毒核酸检测室间质量评价结果报告》中的结果：

• 单靶标(ORF1ab)试剂仅一家，三靶标(ORF1ab、N与E)检测试剂两家，主要为双靶标(ORF1ab与N)检测试剂；

• 双靶标试剂检出了202010号检测限浓度(128 copies/mL)阳性样本，单靶标与三靶标试剂未能检出；

• 三靶标检测试剂的复检率相对更高；

• 各试剂对不同靶标基因的灵敏度存在差异，N区的阳性率高于ORF区，样本阳性越弱，这一现象越显著。

  
  

可以看出，就新冠检测试剂而言，设计同时针对两个靶标的引物和探针，可以最大程度的保证特异性并避免漏检的发生。但靶标基因数如果再多，反过来又会降低检测的灵敏度。

就PCR体系而言，不同厂家的检测试剂盒成分存在差异，引物、探针设计策略等因素都可能会对试剂盒灵敏度、特异性产生较大影响；其次，不同厂家的试剂研发能力参差不齐，若对PCR体系中各种影响因素的把控能力不够，则会极大程度地影响试剂盒的检测性能。另外，各实验室人员的操作能力存在差异，还是以本次新冠病毒检测的室间质评结果为例，即使是两家选取了两个相同靶标基因的试剂，在检出率和符合率指标上也会有较大差异，以上所说的因素都有可能造成这一结果。