超多重PCR技术及其在临床病原微生物检测的应用（三）

2.2.2 基于分子的病原体检测技术

2.2.2.1蛋白检测

目前针对病原体蛋白的直接检测使用质谱技术，基于已建立的微生物胞膜蛋白质、脂多糖、核酸等的数据库对微生物进行精准鉴定和分析。质谱方法针对培养后浓度较高、品种较为单一的待测样品，通过获得其蛋白质图谱，再与已知微生物构建的数据库的参考图谱进行比对，从而鉴定病原微生物。质谱检测技术高效快速且成本低，加之其高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，在临床微生物检测等方面获得了广泛的应用，用于多类型样本中细菌和真菌的直接鉴定。但目前仅能处理培养后菌株等相对单纯样品，难以对原始临床标本中复杂背景样品进行病原检测，检测内容也仅限于病原体分型，在生物耐药性分析和毒力研究等方面进展较少。

2.2.2.2核酸检测

基于核酸的检测早期使用PCR的方式，对病原微生物基因组或转录组片段进行特异性扩增，再对扩增片段进行鉴定或片段扩增进程进行分析，从而实现病原体的鉴定。

PCR技术的具体原理如上文所述，在病原微生物领域使用到的PCR衍生技术包括逆转录PCR(RT-PCR)（获得RNA病毒的cDNA文库并用以后续检测）、半巢式和巢式聚合PCR (seminested PCR 和 nested PCR)、多重PCR（mPCR）以及多通道荧光定量PCR等。这些衍生技术有各自特点，能有效应用于环境病原体检测。如巢式PCR。巢式PCR是常规PCR的一种演变，其增强了反应特异性和目标扩增子的产量。巢式PCR中设计有两对引物：第一对（外引物）在目标扩增区域的侧翼，这一对PCR引物扩增过程和普通PCR相似。而第二对引物（巢式引物）结合在第一次PCR产物内部，对应于所扩增DNA的准确区域，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。

与普通PCR相比，巢式PCR 克服了单次扩增平台期效应的限制，使扩增倍数提高，从而极大的提高了PCR的敏感性。巢式引物扩增的模板是外侧引物扩增的产物，第二阶段反应能否进行，也是对第一阶段反应正确性的鉴定，因引可以保证整个反应的准确性及可行性。对于是样品中目的基因的表达丰度较低的情况下，巢式PCR的优势突显。但相比传统PCR，巢式PCR在进行第二次扩增时引起交叉污染的几率较大。巢式PCR检测目标病原多为病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。

多重PCR的引入增加了病原体的检测通量，但市面上的多重PCR扩增大多基于细菌的16S或23S或真菌的18S。针对这一区域进行扩增，在设计引物时，不同种病原体的引物片段存在重叠，限制了多重PCR一次反应能够特异性扩增的病原体数量，一般情况下很难实现超过30种特异性片段的同时扩增。

PCR特异性扩增后检测是否存在特异性扩增片段以实现病原体的鉴定方面，可用的方法除了上文提到的电泳法，还包括热熔曲线法、基因芯片等方式。

热熔曲线法是在正常的PCR反应基础上加一个溶解曲线的反应条件，溶解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。PCR扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生溶解曲线.其中当温度由60℃升至95℃时，PCR仪每隔一定的温度检测一次信号。最后将收集的信号绘制出溶解曲线。随着反应中双链DNA变性，荧光染料又回复到游离状态导至荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图，在扩增产物的溶解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50%的温度，与不同DNA片段的碱基组成相关），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度溶解。每一条线代表着某个孔里的反应体系里产物的单一情况，某一条线如果为单峰且在一定合理的温度范围内（一般为80~90℃）则认为正常，如果为双峰则可能有非特异性扩增。由此可以判断产物是否为目的基因且是否单一。可以看出，该方法实际上检测的是不同扩增片段DNA碱基所占比（GC比），因此仅能作为近似模拟，无法精准保证扩增片段一定是目的基因片段，对于病原体鉴定的精确度相对有限，同时稳定性依然有待提高。

总的来说，传统病原学培养的遍耗时较长且存在一定的假阳性率。多种因素影响标本质量，从而影响培养结果的准确性，且绝大多数病原体不可培养。还有以PCR为基础的分子诊断技术在敏感性、特异性和检测时效上明显优于培养法，但因为该法基于已知病原菌的基因序列进行定向检测，在无法实现超多重PCR的前提下所能提供的信息有限，依然不能很有效地解决临床诊断阳性率低的问题；除此之外，对于混合感染和未知致病微生物的检测是传统检测方法无法逾越的障碍。据统计，超过1/3的复杂感染性疾病患者因传统检测方法无法确定病原体信息，不能得到及时有效地救治，从而使病情恶化。且如今疑难感染病例不断增多，传统诊断方法跟不上微生物进化和变异的节奏，传染病的传播速度明显加快，而临床检测方法的局限常常导至错误用药和延误治疗，故此尽快发展新的能满足临床需求的检测方法刻不容缓。

表1.常规病原微生物检测技术对比

图4. mNGS检测步骤(来源：Nature Reviews 2019)

mNGS检测方法首先将微生物细胞的细胞壁、细胞膜打破，使基因组DNA释放出来，然后根据DNA的特质，将其从结合的蛋白质中分离出来。得到纯化的宏基因组DNA后，通过微量提取及建库方法，制备病原体核酸文库，并对其核酸序列进行高通量测序。mNGS的高通量测序方法先后有罗氏454焦磷酸测序技术、Illumina（Solexa测序技术）、SOLiD测序技术和Ion Torrent测序技术。目前市场上以Illumina（Solexa测序技术）为主，Ion Torrent测序技术为辅。高通量测序后将所得核酸序列与微生物专用数据库中病原体标准序列进行同源性或序列特征比对分析，从而得到鉴定结果。这种方法不依赖于细菌培养，从取样，核酸提取及建库到测序、生信分析及报告时间仅需约24小时，且可同时检测理论上所有已完成基因组测序的病原体，具有十分强大的检测性能。

mNGS 对脓毒症、重症肺部感染等严重感染具有较高的临床应用价值，能快速、精准地找到病原体并对抗菌药物治疗方案的制定和治疗效果的评估有一定的指导作用。目前mNGS技术已逐步用于临床疑难感染诊断，203年C.Y.Chiu 教授首次成功应用mNGS技术为一位不明原因发热的男孩确诊为钩端螺旋体脑炎。2014年中国协和医院关鸿志教授用mNGS确诊了人类疱疹病毒脑炎。2016年深圳第三医院用mNGS技术确诊了一例罕见阿米巴脑炎。2017年中国华山医院张文宏教授应用mNGS技术先后确诊了跨物种传播的狂犬病毒以及锥虫感染等，并给与针性治疗使患者痊愈。这些成功案例无一不预示着mNGS技术在生物监测领域上广阔的发展前景。

尽管mNGS 用于临床病原诊断具有诸多优势，但其技术仍然面临着一些挑战。例如，在测序中真正有意义的基因片段比例较低。采样时样本难以完全排除人源细胞，而人类基因组的大小（3Gb）远大于细菌的基因组（3Mb）。当人源细胞和细菌数量为1：1时，测序信号中人源基因片段数量与细菌基因片段高达2000：1，这意味着目标基因片段在整体样本中的含量较低，会导至检测成本整体偏高，并可能会出现目标基因片段太小而致使无法明确检测病原种属的可能。在临床应用上，mNGS技术还存在一些目前难以解决的问题：

1. 难以mNGS技术检出的病原体只能代表标本中存在这些检出微生物，无法具体确定是定植菌、背景菌还是致病菌。

2. mNGS技术对于胞内菌、真菌两类微生物检测敏感性较低：由于测序成本的限制，mNGS需尽量排除人源细胞的干扰。因此针对胞内感染菌如结核分枝杆菌、军团菌等，由于其在体液内密度较低而导至检测敏感性偏低；同时mNGS对于具有较厚细胞壁的病原体及真菌核酸提取效率较低，导至检出率和敏感性较低。

3.  mNGS检测技术对RNA病毒检测难度大：RNA转录本身有更高的丰度和复杂度，又容易降解，对运输和保存的要求较高，因此RNA病毒的临床检测还存在一定的困难。

4. 在耐药检测上，目前使用 mNGS 进行耐药基因检测还存在一定的困难。现有检测方法因成本考虑导至耐药相关基因覆盖度较低，难以高灵敏度地检测出相关耐药基因。

5.从测序结果的可靠程度来讲，不同的公司，对于可靠程度的数据采用不同的报告方法，如深度、覆盖度、丰度、估测浓度、置信度，各有千秋，尚无统一标准；同一公司相同样本测序报告结果的稳定性同样也是需要更进一步提升的因素。

2.2.3.2 tNGS法病原体检测的操作流程及优势分析

针对mNGS方法在临床上检测灵敏度和成本的诸多问题，tNGS可在增加样本中病原微生物信息、提高灵敏度的前提下大大减少测序数据量，从而实现性能及成本的双重优化。总的来说，tNGS 检测包括以下几个主要步骤：

1.  采集临床样本并进行核酸抽提，针对RNA病毒进行检测还需补充反转录获得cDNA这一步骤；

2.  PCR靶向扩增，设计针对感兴趣病原微生物基因片段的特异性引物，靶向扩增相关序列。这一步可实现信号放大的目的，同时由于人源基因、定植菌基因及其他背景基因片段并未扩增，因此有效地排除了背景DNA对于后续NGS的影响；

3.  第二轮PCR反应并进行NGS 建库，

4.  PCR产物质量检测及NGS测序

5.  生信分析和检测报告