前言
化学发光技术已经成为当前免疫诊断市场中最重要的检测技术。自上世纪70年代诞生以来,尽管随着检测设备全自动化水平以及检测元件精密度、试剂生产保存工艺的发展,化学发光技术的检测灵敏度有了显著的提升,然而究其本质而言,无论是酶促发光、直接发光或是电化学发光,化学发光技术在检测原理上在过去的近50年里并没有得到任何改变。可以认为在自动化水平已经达到相当高程度的今天,化学发光技术在现有抗体亲和力水平的前提下,已经接近了其检测能力的极限。
免疫诊断市场在新型标志物或新型诊断市场上的开拓,可能需要一种从检测原理层面进行变革的新型免疫诊断技术——单分子免疫检测。
本文将分为以下几个部分探讨下一代免疫诊断技术——单分子免疫检测对现有免疫诊断市场的影响以及在体外诊断市场普及应用的可行性。
(1) 化学发光发展现状
(2) 单分子检测技术——生物检测技术的极限标尺
(3) 从化学发光到单分子免疫检测有多远
(4) 数字PCR技术的发展给单分子免疫检测的启示
(5) 单分子免疫检测技术发展现状
(6) 单分子免疫检测平台技术分析
(7) 单分子检测技术是分子检测与免疫检测平台统一化的可行桥梁
(8) 超低成本单分子免疫检测技术实现的可能性
1. 化学发光技术发展现状
当今全球范围内,免疫诊断市场呈现以大型全自动化学发光为主流,多种检测技术原理、检测平台形式多样化发展的局面。
国内高端免疫诊断市场中,大型全自动化学发光设备基本处于罗氏、雅培、西门子等国际巨头企业垄断状态。尽管迈瑞、新产业等国内龙头企业近几年得到迅速发展,但是短期内依然难以改变目前市场份额分配的局势。
而在POCT细分领域,则有以梅里埃VIDAS、三菱PATHFAST、星童Pylon等为代表的小型全自动单人份POCT试剂条,以美艾利尔、广州万孚、南京基蛋为代表的免疫层析试纸,以及雅培iSTAT、华迈兴微极光系列、理邦的磁敏免疫产品为代表的微流控POCT产品。化学发光技术凭借其绝对领先的灵敏度、准确性与精密度,无疑是当前免疫诊断技术中最可靠的检测方法,它贯穿了从全自动大型设备,到小型全自动POCT设备甚至到微流控POCT的全线免疫诊断产品。
然而,当我们对免疫诊断技术发展历史进行梳理时候,就会发现化学发光并不是一个新技术。化学发光技术从上世纪70年代中期诞生,到上世纪末以及本世纪初由于罗氏、雅培、西门子等企业通过收购或自主研发推出各大早期化学发光平台而受到广泛关注,再到近十年随着自动化技术的迅速发展,替代了酶联免疫成为免疫诊断市场最核心的技术,已经经历了超过40年的时间。
而在这40年里,无论是酶促化学发光、直接化学发光或是电化学发光,化学发光的检测技术却并没有任何检测原理层面上的改变,现有的化学发光检测在灵敏度、准确度的提升几乎是完全依赖于自动化设备精密度的提升以及发光分子衍生物结构上的改造。
在过去化学发光技术快速发展的近二十年里,我们习惯了依赖于自动化技术快速发展给免疫诊断市场带来的精确度与可靠性的提升,却也习惯了化学发光方法在检测技术原理上给我们带来试剂或设备层面的各种枷锁,形成了定式思维,难以在检测原理层面实现革新。
2. 单分子检测技术——生物检测技术的极限标尺
1967年法国数学家B.B.Mandelbrot在其分形理论中提出了“英国的海岸线有多长”的问题。该理论认为,英国海岸线的长度取决于测量尺子的精确程度。随着尺子逐渐变小,精确程度逐渐提高,测量所得的海岸线长度将无限增大。与“英国海岸线有多长”的问题相似,我们对生命科学领域的认知范围也是随着各种生物检测技术灵敏度和精确程度的提升而逐渐提升的。
不同的是,在生物分析检测领域,尺子的最小尺寸似乎是有极限的——单分子水平。包括核酸、蛋白质或是多糖在内的绝大部分生物分析系统,当检测对象超越了分子水平到达原子水平,检测都将失去其本来的意义。单分子水平的生物标志物的研究,为前沿科学领域、医疗诊断领域都提供了难以估量的学术价值与市场机会。
3. 从化学发光到单分子免疫检测有多远
图1 吖啶酯发光过程中的光子方向随机性
现有的化学发光技术是一种自上而下的检测逻辑,它通过测量溶液整体光学信号强度换算分子浓度。以吖啶酯化学发光为例,化学发光设备通常是以光电倍增管(PMT)直接检测溶液整体释放的光子数,通过积分或发光强度的形式来实现定量检测。现有的化学发光体系为了提高吖啶酯化学发光检测体系的灵敏度,除了抗体亲和性因素的影响,更为简单直接的方法就是提高反应体系的整体体积,从而在一定样品浓度下提高检测液中结合的吖啶酯分子的总数,来提高被PMT检测到的光子总数。然而这种检测形式并不适合于单分子水平的检测。
要实现单分子免疫检测必须要实现两个前提:
(1)单分子信号检测
(2)单分子信号溯源。
前者是单分子检测的基础条件,而后者则是通过单分子计数实现定量检测的必须条件。
现有的化学发光技术不可能实现单分子免疫检测,其检测灵敏度下限的瓶颈来源于分子层面的不确定性。吖啶酯分子在遇到发光激发底物时,会在极短的时间内释放数个光子,其后结构迅速遭到破坏失去发光能力。由于吖啶酯分子在释放光子时,光子方向是不可控的,而作为发光检测设备的核心部件光电倍增管却是有方向性的(图1)。这就使得单个吖啶酯释放的少数几个光子不能确保被PMT检测到(不满足第一点前提条件),同时PMT上捕获的光子信号也不可能对溶液中单个吖啶酯分子进行溯源(不满足第二点前提条件)。
当样品中的抗原分子浓度低到一定程度时,PMT能够捕获到光子数量的不确定性将呈指数级提高,导至检测信号完全被埋没于背景噪音中,失去定量检测能力。同样的问题也存在于电化学发光和酶促化学发光体系中。
因此,在设备自动化技术已经发展到相当高水平的今天,现有的化学发光技术检测灵敏度已经接近于其理论上的检测极限水平。
对于现有的免疫检测体系而言,若需要以更高灵敏度的检测方法去探寻新的生物标志物,或是开发新型免疫诊断市场方向,势必需要在检测原理层面上进行技术本质的革新。
4. 数字PCR技术的发展给单分子免疫检测的启示
图2 数字PCR工作原理
(PNASAugust 3, 1999 96 (16) 9236-9241; DOI: pnas.96.16.9236)