前言
化学发光技术已经成为当前免疫诊断市场中最重要的检测技术。自上世纪70年代诞生以来，尽管随着检测设备全自动化水平以及检测元件精密度、试剂生产保存工艺的发展，化学发光技术的检测灵敏度有了显著的提升，然而究其本质而言，无论是酶促发光、直接发光或是电化学发光，化学发光技术在检测原理上在过去的近50年里并没有得到任何改变。可以认为在自动化水平已经达到相当高程度的今天，化学发光技术在现有抗体亲和力水平的前提下，已经接近了其检测能力的极限。
免疫诊断市场在新型标志物或新型诊断市场上的开拓，可能需要一种从检测原理层面进行变革的新型免疫诊断技术——单分子免疫检测。
本文将分为以下几个部分探讨下一代免疫诊断技术——单分子免疫检测对现有免疫诊断市场的影响以及在体外诊断市场普及应用的可行性。
上篇我们介绍了以下内容:
（1） 化学发光发展现状
（2） 单分子检测技术——生物检测技术的极限标尺
（3） 从化学发光到单分子免疫检测有多远
（4） 数字PCR技术的发展给单分子免疫检测的启示
下篇聊聊以下部分：
（5） 单分子免疫检测技术发展现状
（6） 单分子免疫检测平台技术分析
（7） 单分子检测技术是分子检测与免疫检测平台统一化的可行桥梁
（8） 超低成本单分子免疫检测技术实现的可能性
5. 分子免疫检测技术发展现状
单分子免疫检测是指通过免疫标记的方法，利用抗体捕获和识别抗原，进行信号分子标记或是酶联标记的形式，通过单分子荧光信号检测或单分子酶促反应实现的单分子级别蛋白分子的检测，其检测灵敏度远超现有的化学发光技术平台。
目前全球范围内，已商品化的单分子级别免疫检测的技术平台仅有Quanterix公司的SiMoA系统和Merck的SMC系统。
美国Quanterix公司的创始人是David Walt，他是美国塔夫茨大学化学系的教授，不仅是美国国家科学院和工程院的双料院士，还是基因测序龙头企业Illumina公司的创始人。
2007年，David Walt在美国马萨诸塞州创立了公司QuanterixCorporation，首次推出SiMoA技术。
2013年该公司上市了科研系列产品——基于SiMoA技术的检测设备。
2015年推出第二代基于SiMoA技术的检测设备，并于该年取得1000多万美元销售额。
2017年，公司实现超过2000万美元的销售收入。
SiMoA（Single Molecule Array）系统源自于DavidWalt与David Duffy的团队开发的一套“DigitalELISA”检测系统。其检测原理与数字PCR近似，都是通过微反应器单元进行单分子隔离结合单分子水平信号放大来实现的。
SiMoA系统通过免疫反应将磁珠捕获的抗原分子使用半乳糖苷酶标记，再将其分散到微米尺度的微孔阵列中，通过使用油相进行物理上的隔绝，让微孔中单分子半乳糖苷酶进行酶促反应，产生荧光信号。其检测端与数字PCR相同，使用“0”与“1”对根据微孔荧光强度进行标记，通过“1”和“0”的计数和占比分析实现单分子计数以及超高灵敏度的蛋白检测分析。
表2 Quanterix Corp融资历史
由于SiMoA技术远远领先于现有的各类免疫诊断技术，其单分子水平的检测能力更是被认为“将改变整个蛋白标志物检测市场游戏规则”，因而深受资本市场的认可。
Quanterix公司的融资历史如表2所示，公司于D轮获得了5450万美元的融资，其中包括了国内企业乐普医疗通过乐普-民和全球精准医疗创新投资基金增资的1100万美元，用于公司IVD产品的开发注册与推广。公司于2017年末在纳斯达克上市。
SiMoA系统的出现，彻底打破了免疫诊断市场中，现有的检测技术在检测能力或检测灵敏度水平的极限，使得单分子蛋白检测成为了可能。受限于SiMoA复杂的操作流程以及难以控制的高昂试剂耗材制造成本，尽管Quanterix公司2016、2017年已实现1758.50万美元、2287.40万美元的营业收入，其亏损额度却高达2317.3万美元和2701.9万美元。
但是，这依然不能阻碍SiMoA系统所代表的单分子免疫检测技术成为近几年海外在免疫检测技术当中最趋之若鹜的方向。
继SiMoA系统之后，Merck公司主推的SMC（SingleMolecule Counting）系统最早由Singulex公司开发，于2015年由MerckLife Technology收购其生命科学领域的使用权。Erenna系统是SMC第一代单分子检测设备，该设备通过流式分子扫描检测的方法，实现分子计数功能。
由于受限于Erenna设备的制造成本和稳定性问题，2018年初，Merck公司推出了第二代单分子免疫检测设备SMCxPRO。SMCxPRO于2018年5月前后在国内市场开始推广，国内单台设备售价超过20万美元，96人份·的试剂盒市场售价均超过2000美元，研发用试剂盒更是高达6000美元（30test）。截至目前为止，该设备国内销量已超过6台。
与SiMoA技术使用的单分子酶催化信号放大策略不同，SMC技术采用更为直接的设备依赖型单分子检测方法。SMC系统中，将激光聚焦到光学极限尺度范围内，使得微米尺度的聚焦光斑范围内的激发光源能量达到一个极高程度。在这个光斑中，通过免疫反应标记的单个或数个荧光染料分子将释放出足够多的光子以确保被PMT检测到，实现单个分子的计数功能。
继SiMoA系统之后，SMC系统再次让单分子免疫检测技术进入相关领域的视野，进一步引发业内人员对下一代免疫诊断技术的思考。
6. 单分子免疫检测平台技术分析
6.1 SiMoA系统
图3 SiMoA操作流程示意图
图4 SiMoA HD-1 Analyzer设备图
SiMoA通过磁珠酶联免疫反应与微孔阵列芯片的结合，实现单分子蛋白检测。其操作流程如下：
（1）利用表面标记有捕获抗体的磁珠捕获样品中的抗原；
（2）使用biotin标记的检测抗体对被捕获的抗原进行标记；
（3）加入链霉亲和素——半乳糖苷酶复合物，与检测抗体上的biotin结合；
（4）将反应洗净后的磁珠与底物混合，加载到含有微孔阵列的检测芯片中，利用磁场使磁珠落入与其尺寸完全匹配的微孔中（3μm左右），加入油相，使得微孔之间物理隔离；
（5）含有半乳糖苷酶的微孔由于酶分子催化底物产生荧光产物；
（6）对微孔阵列进行荧光成像，通过对发出荧光信号的微孔个数对照标准曲线来实现定量检测。
首页
