一、单分子免疫检测技术概述
1.单分子免疫检测技术概念
（1）SMD技术的含义
单分子检测技术(Single Molecule Detection，简称SMD)是指在单分子水平上通过生物分子的构象变化、动力学、分子之间相互作用以及对单个分子进行操纵等方式进行检测,是一种适用于单分子水平上探求分子的基本物理和化学原理的独特技术，一种新型的超灵敏检测手段, 在生物分子的定量检测领域有广阔应用前景。
与整体分析法相比，单分子检测（SMD）方法能提供观测物的分布和时间轨道，能够对异质群体中的单个分子进行观察、鉴定和分类，能提供直接的生物大分子的结构和功能之间关系的信息。SMD技术能测定一些在整体水平上不可能同步进行的化学反应的中间产物，而这些信息是用传统的整体分析方法非常困难、或不可能得到的。
（2）SMD技术的主要特点
检测空间尺度在纳米数量级，检测的分子数目或相关事件一般在几个（次）到几千个（次）的范围。
2.SMD的种类
目前, 单分子检测技术可以分为两类: 一类是荧光成像(包括离体和在体成像)及光谱学, 一类是基于力学的操作和检测(包括光阱、磁阱、原子力显微镜及纳米孔等)，另一类是)电化学检测法。
单分子荧光检测由于具有信噪比高、灵敏度高和样品消耗少等特征，可对单个分子、微粒、细胞及病毒等进行检测和成像, 可用于研究在溶液中极难观察到的小概率事件、动力学慢事件和异常分布；以及可实时监测生化反应过程研究分子结构与功能之间的关系等显著优势，因而成为单分子检测技术中发展最为迅速的一种。
3.SMD应用领域
总的来看，该技术已被广泛应用于多种疾病生物标志物的检测，包括心血管疾病，炎症，糖尿病，神经疾病，癌症等等，使研究者对生物标志物的应用和认识达到了全新的高度。
二、单分子免疫检测技术原理
当下实现SMD目的最常用的方法有三大类：电子显微技术、化学方法和光学方法。
这些方法实现单分子检测的原理是：(1)高的空间分辨能力；(2)单分子性质和行为的捕获能力；(3)收集微弱信号经放大，并做相应的分析处理以获取可用信息的能力。
单分子荧光检测技术原理：
在激光照射下，荧光分子从基态到激发态，发射光子回到基态。根据荧光寿命和分子在激光束中停留时间，可算出单个分子发射的最大光子数为105-106。目前光学检测系统收集、检测光子的效率为1%或0.5%-5%，故单个分子仍可被检测到数千光子信号。检出限约为，应用最广。
三、SMD技术的关键点
实现单分子免疫检测是分析化学检测的一个终极目标，但是由于单分子检测对象的浓度极低，因此在实际操作中会出现很多的干扰因素，影响检测结果。如何提高检测的效率，尽可能的降低检测带来的误差，也成为这一领域的研究目标。正如Keller所说：“单分子检测能力的高低与其说是检测灵敏度的提高，不如说是背景噪音的降低”。其技术关键点如下所示：
1.杂散光/噪声背景的消除
单分子检测的过程中，我们常常需要克服一个关键难点：杂散光背景比荧光信号大很多。因此为了更好的实现单个分子的检测，必须最大化的降低杂散光的干扰。杂散光的主要来源：瑞利散射光、光学器件散射光、样品的自发荧光、检测器暗电流、溶液的拉曼散射。杂散光/噪声对检测的影响极为严重。
为了降低噪声，要选择低噪声、高效的光学材料元件和检测器，对溶液进行过滤，对溶液、载体进行预漂白；此外，还可以通过选择合适的激发与发射波长以降低背景噪声。
而当检测到“光子爆发”时，利用数字滤波技术可以根据光子爆发的形状来判断它的来源，从而最有效地对染料分子的光子爆发进行识别，进一步滤除杂散光背景，提高信噪比。
2.提高光子检测效率
检测器是单分子荧光探测的关键部分，由于单个分子的荧光很弱，这就要求荧光检测器具有较高的量子效率和很低的暗计数。目前常用的超敏检测器是ICCD和APD，最终希望光子检测效率达到0.1％以上。
目前，提高光子检测效率可采取的主要措施有：①提高光子收集效率，减少传输过程中的损失。在整个光子传输的过程中，现在主要运用的是光纤导线传输，有效的提高收集量；②使用单光子检测器。
3.提高信号强度
提高信号强度可以选择的策略有：①选择体积大的荧光探针载体（如纳米微球），加大焚光探针数量；②选择多重标记的荧光探针载体，也就是在一个分子上同时标记多个荧光分子；③挑选荧光强度高的荧光探针；④可以通过纳米材料（如纳米金、纳米银、量子点等）的辅佐，增加荧光强度。
四、单分子免疫检测发展难点及趋势
1.发展难点
应该指出的是, 单分子检测技术仍面临着许多挑战。例如, 生物大分子标记位点的专一性, 荧光性能与FRET效率对环境及染料取向的依赖性, 荧光探针的量子产率、光闪烁和光漂白等光物理性质影响, 还有目前的单分子检测仪器价格昂贵、操作复杂、对较弱荧光信号检测能力不足等。技术层面和商业化层面均存在着较大难点。
2.发展趋势
呈现以下趋势：（1）发展不易光解、性能稳定的荧光标记物和新型标记方法, 提高单分子生物传感器的性能; （2）改进单分子检测仪器, 使其操作更加简单方便、价格更加低廉; （3）将单分子检测与适配体、等温扩增等技术相结合, 提高检测特异性和灵敏度; （4）研发能同时检测多种物质的单分子技术, 研究由多组分构成的复杂分子马达; （5）改进单分子检测方法, 在接近生理条件、活细胞甚至是生物整体水平中实现单分子实时检测。
五、单分子免疫检测产品分析
单分子检测技术被正式商业化的产品极少，在国外仅有少数几家，在国内则主要停留在实验室科研层面上，有商业化能力的公司也凤毛麟角。
1.目前国外已商品化的主要有美国Quanterix公司开发的SiMoA系统，以及Merck公司推出的SMCxPro系统。基于SiMoA技术的检测设备在2017年实现超2000万美元的销售收入；SMCxPro系统自2018年5月推出以来，单台设备售价超20万美元。
2.国内商用化的有宇测生物基于MCQ技术开发的单分子级别的免疫检测系统Astra System，其实现了2-4个数量级检测灵敏度的提升、非稀释条件下5-6个数量级的动态检测范围。最终的技术产品在快速检测模式下可以在7分钟内完成，灵敏度下限可以达到10 pg/mL以下。远领先于市场上现有的化学发光技术。
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