关于WB实验中蛋白样品制备的常见问题分析

　WB实验又称免疫印迹实验，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。

　　对于一直都在做蛋白研究的你，在样品制备中的小细节你都了解吗？这里为大家整理了蛋白样品制备中大大小小的常见问题，一起来学习吧！

　　1、所有WB实验都用总蛋白就可以完成吗？

　　当然不是，要根据WB的实验目的来确定提取哪类蛋白，如需验证某些低丰度蛋白，或蛋白定位，或组分间表达量对比，则需要进行亚细胞结构分离或组分分离。

　　2、如需添加蛋白酶抑制剂该如何添加？

　　内源性蛋白酶存在于胞浆中，所以要在细胞裂解前加入抑制剂到达理想的抑制效果，提取时将抑制剂添加到裂解液中，工作浓度1X。例如100X蛋白酶抑制剂，1ml裂解液中添加10ul即可。

　　3、蛋白样品如何储存？

　　A蛋白样品不建议久存，也不要反复冻融。下游做WB实验，建议蛋白浓度测定后，加入loadingbuffer煮样，煮后根据实验需要分装成小管在-80℃，下次使用前拿出小管再次煮样即可。

　　4、样品上样前怎么处理？

　　蛋白浓度测定后，建议将各个样品稀释到某一固定浓度（稀释可以PBS，水或裂解液），加入loadingbuffer后，在沸水中煮3-5分钟，使蛋白充分变性，也可使用PCR仪95度加热5分钟。

　　5、组织样品含血量多可以直接提蛋白吗？

　　如组织样品中含血较多，血红蛋白可能会影响WB实验，可以在组织样品裂解前使用红细胞裂解液进行处理后，再进行蛋白提取。