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1.模板纯度,有较多蛋白或其他杂质时,会一定程度影响pcr效率;2.模板量,过高的模板量反而会降低pcr效率和特异性;3.引物,引物的长度需要再效率和特异性间获得优化,其次要控制引物gc含量;4.聚合酶,要考虑酶的保真率和速度;5.mg离子浓度,mg离子浓度过高会降低特异性,浓度过低会降低效率;6.退火温度:退火温度低,效率会高,但特异性降低;退火温度高,效率降低,但特异性会提高;需优化。