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常见的PCR反应抑制物一览

2021.6.23
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

一个PCR反应过程分为很多的步骤,同时也受到很多因素的影响,可以分为内部因素和外部因素,内部因素是指正常试剂体系中的成分,外部因素是指环境或者样本带入的因素。


体系内部因素


引物:引物是整个PCR体系最重要的部分,也是决定一个PCR反应特异性的关键,引物在设计时要遵守一定的原则(长度、扩增跨度、碱基等)。

酶及其浓度:目前有两种Taq DNA聚合酶,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠杆菌合成的基因工程酶,酶浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。

dNTP的质量与浓度:dNTP溶液呈酸性,一般配置成体系需将其调节至7.0-7.5,正常情况下4种dNTP的浓度应该相等,如果其中某一种过高就会引起错配,浓度过低又会引起PCR产物的产量。

模板核酸(靶标):模板核酸的量和纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,对于RNA模板更要注意RNA的降解。

Mg2+浓度:主要影响PCR扩增的特异性和产量,一般要对应dNTP的浓度。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异性扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。

温度与时间的设置:PCR原理三步骤涉及变性-退火-延伸三个温度点,也就是变性温度与时间、退火(复性)温度与时间、延伸温度与时间。

循环次数:循环次数决定PCR扩增程度,PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般温度循环次数在30-40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量就越多。


体系外部因素



除上述抑制剂外,还存在一定的PCR增强剂,比如甜菜碱、二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、PEG、亚精胺和单链DNA结合蛋白等,但是在高浓度情况下,也会对PCR产生抑制,因此如何采用增强剂消除抑制剂的影响,采用多少的浓度对结果都存在很大的影响。


临床PCR常见问题


1

假阳性问题

方法学问题:靶基因序列特异性、引物错配、非特异性扩增
污染问题:样本污染、产物污染、产物污染
解决办法:严格区分试验区域及人员培训,使用UNG技术


2

假阴性问题

问题来源:试剂因素、操作因素、仪器因素、标本因素
解决办法:
设置阳性对照监测试剂问题
降低操作难度,提高操作人员水平
室内质控、室间质控监控
使用抗干扰能力强的试剂提取样本




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