层析方法
1. 用去离子水稀释细菌裂解物至电导率为 35-40mS / cm。稀释取决于样品制备过程中添加的 CaCl2 浓度。
2. 将稀释的样品用 0.45μm 过滤器进行过滤。
3. 将 20CV 的缓冲液 A1 平衡 DEAE 柱。
4. 将澄清的稀释细菌裂解液进行上样。
5. 用 20 CV 的缓冲液 A1 对色谱柱进行流洗。
6. 用 20 CV 的缓冲液 A2 对色谱柱进行流洗。
7. 用 20 CV 的缓冲液 A3（以半工作流速）洗脱并收集 pDNA。
图 1：AEX CIMmultus™DEAE（2μm）柱上的质粒 DNA 洗脱曲线
在高配体密度丁基修饰的（CIMmultus TM C4 HLD）整体柱上，利用疏水相互作用色谱柱（HIC）的抛光步骤，进一步从 超螺旋（SC）治疗级 pDNA 中除去开环（OC）和线性 pDNA 亚型。
为了富集质粒 DNA 的超螺旋亚型，将 DEAE 洗脱液上样到高配体密度丁基柱（C4 HLD）上。
该步骤进一步去除了杂质。
层析条件
Monolithic column: | CIMmultus™ C4 HLD (2 µm)*2 |
Mobile phase: | Equilibration buffer B0: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 3 M (NH4)2SO4, pH 7.2 |
Washing buffer B1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1.7 M (NH4)2SO4, pH 7.2 | |
Adjustment buffer: 4 M (NH4)2SO4 | |
Elution buffer B2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.4 M (NH4)2SO4 , pH 7.2 | |
Regeneration buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7.2 | |
Working flow rates: | 0.5 – 5 CV/min (具体取决于样品特性、使用的层析设备和色谱柱尺寸) |
*2 选择色谱柱体积，取决于需要处理的样品量。
层析方法
1. 调节来自 DEAE 柱的含 pDNA 洗脱液，每 1 体积（V）洗脱液加入 3 体积（V）的 4M(NH4)2SO4。
2. 用 20CV 的缓冲液 B0 来平衡 C4 HLD 柱。
3. 将 DEAE 柱洗脱的 pDNA 组份上样。
4. 用 20 CV 的缓冲液 B1 流洗色谱柱。
5. 用缓冲液 B2（以半工作流速）洗脱并收集 pDNA。
6. 用 30 CV 的缓冲液 A1 再生色谱柱。
7. 加样 3 次后，对柱子进行清洗。
图 2：在 HIC CIMmultus TM C4 HLD（2μm）柱上分离超螺旋质粒 DNA
· 从 C4 HLD 柱洗脱的超螺旋 pDNA 组份含有硫酸铵，必须在生物应用质粒之前将其除去。
· 缓冲液交换可通过透析滤过或体积排除色谱等方法进行。
· 配置和填充可能需要额外的处理。
二步法层析过程分析：
质粒 DNA 制造成功的关键是实时过程控制方法，确保最终产品中高百分比的超螺旋 pDNA。
CIMac™pDNA 分析柱可用于监测降解产物（开环和线性 pDNA），去除杂质（RNA），并确保每个生产步骤都能产生预期的超螺旋 pDNA 量。
CIMac™pDNA 分析柱还用于超螺旋质粒 DNA 含量的质量控制。
图 3：使用 CIMac™pDNA-0.3 分析柱的质粒 DNA 亚型含量的质量控制
结果和结论：
通过优化裂解、沉淀和两种色谱步骤相结合，可生产满足所有监管要求的纯 pDNA。
可以完成去除 99% 以上的主要杂质（RNA，基因组 DNA，宿主细胞蛋白，内毒素和开环 pDNA）。
此外，快速（大肠杆菌的 pDNA 提取和纯化可在几小时内完成），可重复的过程可降低运营成本并提高工厂生产率。
独特的整体特性有助于该过程的直接可扩展性，涵盖从小规模实验室到大规模工业纯化 pDNA 的生产水平。
Table 1: Process results.
Process yield | > 80 % |
A260/280 | 1.92 |
Homogeneity (SC pDNA) | > 97 % |
HCD – removed | > 99.5 % |
HCP - removed | > 99 % |
Endotoxin | < 2 EU/mg pDNA |
RNA - removed | > 99 % |
点评
目前市面上有不少质粒纯化工艺方案，但是比较下来，BIA 二步法纯化工艺具有两大优势：
效率明显提高
只需两步色谱和高流速的整体柱色谱方案，减少工艺步骤（提高回收率）并加快纯化速度，从而显著提高生产率。
灵活放大
由于特定的整体柱设计，质粒 DNA 过程可以快速扩展到更大的单位。
在 1 毫升色谱柱上设计的工艺可以轻松转移到试验和生产规模。
在 8L 色谱柱上单次运行可以产生 48 g 药物级 scDNA。
Table 2: Scale up options.
Column size | pDNA purified per cycle |
1 mL | 6 mg |
8 mL | 48 mg |
80 mL | 480 mg |
800 ml | 4.8 g |
8000 mL | 48 g |
十多年来，BIA Separations 一直是高效率质粒纯化的好选择。它不仅提供整体柱和平台模板，还提供定制的纯化服务，以完全满足您的质粒 DNA 纯化需求。
进一步阅读：
应用简报：In-Process Control of pDNAProduction on CIMac™ pDNA Analytical Column
Jochen Urthaler, Robert Schlegl, Ales Podgornik, Ales Strancar, Alois Jungbauer, Roman Necina,
Application of monolithsfor plasmid DNA purification: Development and transfer to production, Journal of Chromatography A, Volume 1065, Issue 1, 2005, Pages 93-106, ISSN 0021-9673,
上海精瑞科学仪器有限公司
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