多克隆酶免疫分析筛选方法检测沙门氏菌

多克隆酶免疫分析筛选方法
本方法由酶免疫分析方法(EIA)测得的阳性样品的增菌肉汤和 M 肉汤必须依照常规标准方法中所指示的,在选择性培养基上做划线接种,并必须将典型或可疑菌落按标准方法进行生化和血清学鉴定。

对于阳性结果的确定
①可借助比色计卡进行视觉检查,当判断阴性和阳性对照符合卡上所描述的标准时,阳性结果才有效。
②还可以通过仪器的方法,用带有414nm 滤光片的光度计进行检测,只有当阴性和阳性对照具有可接受的光密度值时,阳性结果才有效。

1、原理 

沙门氏菌抗原的检测是依据与沙门氏菌抗原具高特异性的高纯化的抗体所进行的酶免疫分析来完成的。把沙门氏菌抗原的多克隆抗体吸附于96孔微量滴定板的小孔内表面上,把待检样品也放到板的小孔里。如果样品中含有沙门氏菌抗原,它就与孔内附着的特异性抗体结合,样品中的其他物质都会被冲洗掉。加入接合剂,如果沙门氏菌抗原与吸附在孔内表面的抗体相结合,那么可以进一步与接合剂结合,冲洗孔以洗去未结合上的接合剂,然后加入酶底物,如果样品中有沙门氏菌抗原就会呈现出暗蓝绿色。

2、试剂
①～⑬项可选用 TECRA Salmonella Visual Immunoassay 品名 Bioenterprises PtyLtd,28 Barcoo St Rosevillee,NSW2069,Australia)。若用其他替代品,必须先经试验是等效的。

①抗体吸附板 Removawell^®(Dynatech Laboratories,Inc.)Strips。吸附有沙门氏菌的多克隆抗体,96个孔。如不用应保存在2～8℃。

②托架足以固定每个孔或抗体吸附板。

③对照抗原  一小瓶阳性对照(冻干的),是经过纯化的沙门氏菌抗原,它可以与沙门氏菌的抗体发生反应;一小瓶阴性对照(冻干乳糖),它不与沙门氏菌抗体发生反应。加H₂O复原的抗原保存在2～8℃可以稳定28天。
④对照稀释液  一小瓶(5mL/瓶)含有0.006g Tris(三羟甲基氨基甲烷)、0.044gNaCl、0.0025g 吐温-20和0.005g 水杨乙汞的水溶液。

⑤接合剂  一小瓶(冻干的),含有与辣根过氧化物酶接合的147ng 抗沙门氏菌抗体(从羊来的),0.00686g Na₂B₄O₇,0.12g 葡聚精 T10,0.06g 明胶水解物,0.0024g CaCI₂和120ng 水杨乙汞。加 H₂O 复原的接合剂保存在2～8℃,可以稳定28天。

⑥接合剂稀释液  一小瓶(22mL/瓶),含0.42g Na₂B₄O₇,0.193g NaCl,0.22g 明胶水解物和0.0022g 水杨乙汞水溶液。

⑦酶底物  一小瓶(冻干的)含0.0112g 2,2'-联氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐)和0.123gNaH₂PO₄。加H₂O复原的酶底物保存在2～8℃,可以稳定2个月。

⑧酶底物稀释液  一小瓶(22mL/瓶)含0.116g 柠檬酸,0.0011g H₂O₂,0.0185g NaOH水溶液。

⑨终止液  一小瓶(6mL/瓶)含0.15g NaF 水溶液。(当心:不要碰到皮肤,如果一旦碰到皮肤,应用水冲洗该部位。)

⑩洗液浓缩液  一瓶(25mL/瓶),含1.45g Tris,7.03g NaCl,0.5g 吐温-20和0.0025g水杨乙汞水溶液。

⑪内嵌式包装物(用于固定放置试剂)。

⑫数据记录纸。

⑬比色计卡  目测阴性和阳性试验用。

⑭M肉汤:5.0g 酵母浸膏,12.5g 胰蛋白胨,2.0g D-甘露糖,5.0g 柠檬酸钠,5.0g NaCl,5.0g K₂HPO₄,0.14g MnCl₂,0.8g FeSO₄,0.75g 吐温-80把所有成分悬浮在1LH₂O 中,加热煮沸1～2min。以10mL 分装到每支16mm×125mm 带螺旋盖的试管中,把盖微旋上,在121℃高压灭菌15min。然后把盖旋紧,保存备用,最终pH值应为7.0±0.2。

⑤诊断试剂用于证实EIA试验阳性结果培养物的常规方法所需的试剂。

3、仪器
①培养箱35～37℃。

②多用移液器  精确至50～250μL 和5～50μL 的可调移液器。

③水浴箱  能保持100℃,亦可用调至100℃ 的高压灭菌器代替作为流动蒸汽的发生器。

④塑料挤水瓶500mL,为喷洗液用,也可以用自动清洗器。

⑤塑料包装膜或可以封口的塑料容器在培养时覆盖小孔。

⑥带有 414nm±10nm 和 490nm±10nm 筛选滤光片的酶标仪或双波长读数器,可任选在414nm±10nm 可以通过微量板读出数据。

4、通则

试验盒中的各种成分,在不用时应保存在冰箱里。试验盒只能用一次加完样品、试剂或洗液的孔,不能重新使用。

对于所检验的每一组样品,应有阳性和阴性双重对照抗原,所有的对照都必须对试验是有效的。

用数据记录纸记下每个被检测的样品的位置。

对于每个样品和试验盒的每种试剂,都应用单独的吸嘴,以免发生交叉污染。如果用塑料槽分装接合剂和酶底物,一定要保证不交叉使用。

试验盒中的试剂是作为完整的单位来使用的,不要把不同批号的试剂混合在一起使用。

5、样品制备
①前增菌  把样品置于非抑制性肉汤中,进行前增菌,促使沙门氏菌开始生长。对于不同的产品所用方法也可有所不同,可按照常规培养方法进行。

②选择性增菌  按常规方法,把 1mL 培养过的前增菌液,转种到亚硒酸盐胱氨酸肉汤中,另1mL 转种到四硫磺酸盐肉汤中。除了生的或污染严重的样品外,其他一切食品都在 35℃ 培养6～8h,而生的或严重污染的样品的选择性增菌必须在35℃培养16～20h 。

③后增菌  取出培养后的选择性肉汤,用手或涡旋混合器混匀,从四硫磺酸盐试管取1mL,转种于预热到35℃的含10mL 灭菌的 M 肉汤管中。同样,也从亚硒酸盐胱氨酸试管取1mL,转种到另一支同样的M肉汤管中。除了生的或严重污染的样品外,对于其余的所有食品,均将 M 肉汤管置于35℃培养1～18h,并将其选择性增菌肉汤管放回35℃培养箱再继续培养16～18h。对于生的或严重污染的样品,把 M 肉汤管置于35℃培养6h,并将其选择性增菌肉汤管放回35℃培养箱再培养6h。

④EIA 分析样品的制备  从培养箱取出M肉汤管,用手或涡旋混合器混匀,从同一样品的每支M肉汤管各取1mL,放入一支干净的带螺帽试管中混合,在沸水浴或在流通蒸汽中加热15min。把③中剩余的 M 肉汤,四硫磺酸盐肉汤和亚硒酸盐肉汤,放冰箱(2～8℃)保存,以备用于 EIA 阳性结果样品的培养证实试验,在 EIA 分析之前,应把热的 M 肉汤冷却至25～37℃。

6、酶标免疫分析

①以下试剂都必须在开始分析之前准备好。

a.合适浓度的冲洗液  用H₂O或无离子水,把一小瓶浓缩洗液在塑料试剂瓶中稀释成1L,塑料挤瓶用于手冲试验板是最理想的。

b.阴性对照和阳性对照  把2mL 对照稀释液加入盛有冻干的阴性对照抗原的小瓶里充分混匀。同样地加 H₂O 复原阳性对照,即把2mL对照稀释液加入盛有冻干的阳性对照抗原的小瓶里,充分混匀。

c.接合剂  把5mL 稀释液,加入装有冻干的接合剂的小瓶中,使其在室温下水化,然后把瓶子中的液体转入到接合剂稀释液的小瓶里慢慢混匀。

d.酶底物  把一小瓶酶底物稀释液倒入冻干的酶底物中,一定要保证其完全溶解,并在用前达到室温,加H₂O复原的酶底物将呈淡绿色。

e.终止液  可以直接用,不需加H₂O复原。

②保证试验盘中有所需数量的测试小孔。一个孔用于食品样品,另四个用做对照,一定要把孔的位置固定,把要用的孔从上面揭去封口薄膜,将加热好的 M 肉汤样品0.2mL 放入一个孔中,在两个孔内各加0.2mL 阴性对照液,在另两孔中各加入0.2mL 阳性对照液,在样品记录纸上记下样品的位置。(注意:一定要在每个测试条的一端写上数字标记。)

③把试验板蒙盖起来,放入实验室标准培养箱,在35～37℃培养30min。试验板一定要蒙盖起来,以防蒸发,可用塑料薄膜或密封的塑料容器。

④培养后,用已装有冲洗溶液的挤水瓶,或用自动清洗机冲洗试验板,其步骤如下。

a.迅速翻转试验板,把孔中的内容物完全倒入一容器中。

b.稳固地把试验板面向下在纸巾上轻扣几次,以除去残余的液体。

c.把冲洗液倒满小孔。

d.重复a～c的步骤两次或更多次。

⑤按④a和④b的方法把试验板排空,然后向每一个孔中加0.2mL 加 H₂O 复原的接合剂,把试验板蒙盖起来,在35～37℃培养30min。

⑥把试验板的内容物排空,并按④a～④c的方法将其充分冲洗四遍,然后按④a和④b的方法将试验板处理干净。

⑦向每个孔中加入0.2mL 加 H₂O 复原的酶底物,在室温下(20～25℃)培养,直到阳性对照的颜色变到与比色卡上指示的阳性对照的颜色一致或读数 A≥1.0时(吸收值)才停止培养。由于颜色发生聚集于孔的周边,所以在检视结果之前,先轻轻敲打试验板的侧边,使孔内液体混合均匀,这是很重要的只有这样才能得到精确的结果。

⑧在每个孔中加入0.02mL 终止液,培养时间大约10～20min。如果超过25min,而吸收值(A)还不能达到1.0,这个实验就无效。

7、读数 

实验室的结果可①目测,或用②微量板读数器。

①把试验盘放到一个白背景上,然后把每个实验孔与比色器的色卡比较。阳性对照应出现很强的蓝绿色,表明所有的试剂功能是正常的。如果阳性对照的颜色比比色器中阳性对照色卡的颜色浅,那么实验无效。如果阴性对照的颜色比比色器中阴性对照色卡的颜色深,说明试验盘可能冲洗得不好,分析必须重新进行,两个抗原对照通过目测应呈现一致。

②蓝绿色终点产物的最大吸收值 A 出现在414nm,所以可以在414nm±10nm 读结果对具有单波长读数器,设置读数器的“零点”(空白)用加有200μL 的底物或H₂O的小孔。双波长的读数器的“零点”(空白)用空气并可将其第二个参考波长定在490nm±10nm。A ≥0.3表明阳性结果。阴性对照的 A<0.2,阳性对照应该是 A≥1.0。

8、EIA阳性样品的证实

EIA 的阳性检视结果,表明可能有沙门氏菌,然而,由于抗体可能与一些其他细菌发生交叉反应,故应按照常规标准培养方法,从四硫磺酸盐肉汤亚硒酸盐胱氨酸肉汤,M 肉汤中取样在 HE,XLD,BS 培养基的平板上划线分离培养,并将典型或可疑菌落进行生化和血清学鉴定。