如何用qpcr计算转基因植物拷贝数

鉴定转基植物第步要确定转基已经稳定整合染色体第二步任务评估少转基拷贝及每转基表达水平何般经游表达载体设计构建及游转化体系建立、转化品系筛选鉴定等系列步骤即获 T 0 代转基植物转化程外源 DNA 随机插入植物基组内插入拷贝数位点都固定插入外源基拷贝数低（1或2）能较表达插入拷贝数则导致表达稳定甚至基沉默现象检测T0代转基植物外源基拷贝数研究其特性基础步骤

其原理待测 DNA 品固定固相载体（硝酸纤维膜或尼龙膜）与标记核酸探针进行杂交与探针同源序列固相 DNA 位置显示杂交信号通检测信号、强弱品定性、定量计算转入拷贝数Southern准确性高、特异性强存费费力缺点另外由于Southern检测经靶片段扩增（PCR）般每电泳通道需要10-30 μgDNA实际操作需要较量植物材料提取DNA转基植物愈伤组织菌条件经筛选、重新化般都比较细弱宜量取外源基插入发基重组造限制性酶切位点丢失Southern 检测些素都制约SouthernT0代转基植物检测外源基拷贝数应用

2、荧光定量PCR

利用新型、灵敏、高通量实荧光定量PCR用于测定原始品系转基绝拷贝数实荧光定量PCR技术种较新DNA定量其定量基本原理PCR反应体系加入非特异性荧光染料（：SYBR GREEN I）或特异性荧光探针（：Taqman 探针）实检测荧光量变化获同品达定荧光信号（阈值）所需循环数：CT值（Cycle Threshold）；通已知浓度标准品CT值与其浓度数绘制标准曲线准确定量品浓度荧光定量 PCR 技术具简便、快捷优点能够效扩增低拷贝靶片段DNA每克品20 pg-10 ng转基进行效检测同与Southern相比荧光定量PCR技术T-DNA 同序列进行扩增能实现转基品系基重组检测

选择种合适阳性标准品绘制标准曲线应用实荧光定量 PCR 技术准确定量模板初始浓度基础近内外科家做同尝试Song（2002）等认理想标准品应该已插入外源基植物基组DNA并且用Southern blot准确测插入外源基拷贝数实际研究难套标准品提替代案根据外源基拷贝数野型植物基组 DNA 按定浓度比率混合制标准曲线例转基玉米外源基拷贝数研究发现加入荧光染料SYBR GREEN I20 μL PCR反应体系应6 ng野型玉米基组DNA作模板量已知玉米基组DNA2.5 × 10.9 bp（ArmuganathanEarle 1999）相应于6 ng玉米基组DNA即计算模拟1、2、4、8、16外源基拷贝应加入质粒 DNA 量

些梯度混合液作标准品绘制标准曲线检测品浓度并计算插入拷贝数实验表明用种获数据 Southern blot 结相致Giovanna（2002）农杆菌介导转基番茄作研究材料选择双元载体T-DNA区两外源基TSWV-N（Tomato spotted wilt virus）、nptⅡ（neomycin phosphoril-transferaseⅡ）单拷贝内源基（endogenous gene）作荧光定量PCR扩增模板检测外源基拷贝数认使用植物基组 DNA 定比例质粒混合液作标准品累积许避免误差比使用种标准品必需预先知道待测植物基组 DNA 精确量并植物基组 DNA 质粒准确定量数情况数据都近似值再混合液作标准品检测每转基植株外源基拷贝数放些误差

提相CT或δ-δCT优点需要每实验制作标准曲线需要优化步骤证明外源基与内源基相同至少相似反应效率即与其定量技术 Southern Blot 相比实定量 PCR 技术特异性高信嗓比特性转基拷贝数定量提供些便与实定量 PCR 相比 DNA 点杂交技术要花费菲