实验室分析方法--液相色谱的定量方法—信号测量

HPLC不仅是一种分离手段,同时也是一种优良的定量分析技术。它不仅能够用于对样品(包括纯样品)中基本或主成分的定量,还能用于对中等浓度多组分混合物的分析以及基体中痕量(10^-9或更低)杂质的浓度评价。精心设计行之有效的分析方法可以对主成分的分析在准确度和精密度两方面显示出较高的水平[精密度为±(1%～2%);准确度为±2%]。色谱法定量的依据是:样品中各组分的质量或其在流动相中的浓度与检测器的响应信号成正比关系。因此,进行色谱定量分析时需要准确测量检测器的响应信号(峰面积或峰高);准确求得比例常数(校正因子);正确选择合适的定量计算方法,将测得的峰面积或峰高换算为组分的含量。

1.噪声与漂移

在介绍的HPLC检测器评价方法中已经详细论述了检测器噪声与漂移的测定方法。然而,对HPLC分析方法来说,仍然需要确定噪声与漂移。尽管皆通过相应的检测器加以测量,然而两者有着本质的差别。前者只是单纯地评价一个单元组件,后者与整个仪器系统及分析方法有关。

噪声是指在没有分析物的情况下基线信号值的不稳定程度,可分为短期、长期和基线飘移三种基本类型。

检测器噪声、泵系统的脉动以及积分系统的电子噪声等许多因素均会引起短期噪声。长期噪声可由外在因素或系统本身引起,长期噪声一旦被识别,一般在确定HPLC方法之前可以被校正。

基线漂移被认为是一种特殊类型的长期噪声,梯度洗脱过程中经常出现。前一次进样洗脱的组分可能会被看作基线飘移,这些强保留组分在再次进样时才被洗脱掉。谱带很宽,有时很难与其他类型的基线飘移区别开来,这种基线问题常在等度分离中出现。修正基线漂移也可能得到较精确的峰高和峰面积的测量结果,色谱工作站一般能够对基线飘移做出很好的修正。

基线飘移有时由检测器性能的变化造成。有些示差检测器对温度波动特别敏感,检测器单元中任何温度改变均会导致输出信号严重飘移。在UV检测器中,灯(老化)的强度或二极管或光电管强度的变化有时也会导致基线飘移。

色谱仪开机预热20min后,记录基线1h,取1h内平行包络线的中心线的起点与终点的差值为检测器基线漂移(图1)。选取所记录基线中噪声较大的5min作为计算噪声的基线以1min为界画平行包络线(如图2所示),按式(1)计算短期基线噪声。五个平行包络线宽度的平均值作为检测器短期基线噪声。 

图1 基线漂移计算示意图

图2 短期基线噪声计算

(1)

式中,N_d表示短期基线噪声;y_i表示第i个平行包络线基线宽度;n是平行包络线的个数(此处n=5)。 

2.峰高

检测器测量被测组分响应值的最简单表达方式是信号峰的高度。对完全分离的单一组分,峰高是指从基线到峰顶点的距离,其中基线值取峰前和峰尾多点数据的平均长期噪声或飘移造成基线改变时,须修正峰高的测量值。

对完全没有分开的峰,可以使用切线铲削的方法来确定峰高,如图3中的主成分峰与峰1。但切线铲削法仅适用于那些小峰处于大峰拖尾部分的情况。不同的色谱工作站对基线的选取、峰起落点的确定有一些差异,因此对这种复杂情形的处理结果可能也会存在一定的差异。

图3 HPLC中的峰高测量

3.峰面积
峰面积是HPLC中最常用的定量方法。完全分离色谱峰的峰面积可定义为信号强度在峰开始到峰终止的这段时间内面积的积分值。

测量峰面积的准确性取决于多种因素,其中基线的正确选取,精确地定义峰起落点是关键,需要收集足够的数据以精确评价真实峰面积。不对称峰或拖尾峰很难确定峰的起落点,从而导致定量不准。色谱工作站中皆有计算峰面积的功能,也可以利用手工来完成。

大多数色谱工作站的峰检测(对峰面积而言)是利用一设定的阈值来判断峰的起落点。不恰当的值设定将会影响定量的准确度,对不同的方法建立可以人工干预进行适当调整。

(1)对称峰的峰面积的测量 

手工计算峰面积通常采用“峰高×峰半宽法”。对于对称峰形,峰面积计算公式为:

(2)

式中,系数1.065为色谱峰与三角形面积之间的校正系数。 

按式(2)计算峰面积时,需注意峰宽测量的准确性。对峰宽小于2mm的色谱峰,通过放大色谱峰后进行测量可以减小计算误差。

(2)不对称峰的峰面积的测量 

在色谱分析中,经常会遇到不对称的色谱峰,如图4所示。对于此类色谱峰,可采用峰高乘以平均峰宽法计算色谱峰峰面积。即选取峰高与在峰高的0.85和0.15处峰宽平均值的乘积来表示该色谱峰峰面积。

(3)

式中,W_0.85、W_0.15分别为峰高的0.85处和0.15处的峰宽。

图4 不对称色谱峰面积的测量

(3)大峰上的小峰的峰面积测量 

分析某主成分中痕量组分时,痕量组分色谱峰会受到主峰的干扰,经常会出现下面的情况:主峰未回到基线,杂质已开始出峰,或在主峰前沿出现一个杂质小峰。常见的情况如图5所示,此时测量附在主峰上的杂质小峰峰面积的关键在于如何确定色谱峰峰高。

 图5 大峰上小峰面积测量

图5(a)所示的峰形,沿主峰底部划出杂质峰的基线,由峰顶点A作主峰基线的垂线AD,与杂质峰的峰底相交于点E,则AE为杂质峰的峰高(h)峰高一半处峰宽为b,则杂质峰峰面积为A=h·b。

图5(b)所示的峰形,首先作峰起点A和终点B的连线AB,从小峰顶点C作AB的垂直线交AB于E,则CE即为小峰的峰高(h),CE一半处峰宽为b(过CE中点作AB平行线,可得b),则杂质峰峰面积为A=h·b。

图5(c)所示的峰形,作峰起点A和终点B的连线,过峰顶点C作AB的垂线,与BA延长线相交于E点,CE即为小峰的峰高(h),CE一半处峰宽为b(过CE中点作AB平行线,可得b),则杂质峰峰面积为A=h·b。

(4)基线漂移时色谱峰面积的测量 

如果峰面积测量时发生基线漂移,当灵敏度不改变时,若产生的色谱峰形状与大峰上小峰的形状相似,计算方法同上。图6所示的峰形,基线的漂移程度不大、色谱峰比较窄。首先划出漂移基线AB,过峰顶点E作时间坐标的垂线,交AB于F,EF即为峰高(h),过EF中点作时间坐标的平行线,得到该色谱峰的半高峰宽(b),该色谱峰峰面积A=h·b。

图7所示的峰形,基线AB漂移较大、色谱峰较宽,此时由顶点E作AB的垂线,与AB相交于G,EG即为色谱峰峰高(h),过EG中点作漂移基线的平行线与色谱峰两侧分别相交于F、H、FH即为半高峰宽(b),该色谱峰峰面积A=h·b。

图6 基线漂移较小的峰面积测量

图7 基线漂移较大时的峰面积测量

图8所示的峰形,2号峰测量时所用的灵敏度与1号峰和3号峰不同,如果变换灵敏度时不影响2号峰的起点和终点的记录,则基线位置及色谱峰面积可按前面所述方法确定。若变换灵敏度时,2号峰的起点和终点位置不能明确确认时,确定峰高较为复杂。先作1号峰和3号峰所用灵敏度档的漂移基线,再由2号峰顶点M作时间坐标的垂线,交漂移基线于A,交时间坐标于O将OA的距离乘(或除)以变挡的倍数,即可确定变挡后漂移的基线与峰高的交点B,连接原点与B,即可得变挡基线MB即为峰高(h),过MB中点作变挡基线的平行线可得2号峰半高峰宽(b)。2号峰的峰面积A=h·b。

图8 灵敏度改变时峰面积的测量

 (5)重叠峰的峰面积测量 

色谱分析中常遇到不能完全分离的重叠峰,如图9和图10所示,其色谱峰面积测量有所差异。

图9所示的峰形,两色谱峰交点位于小峰半峰高以下,可按上述方法测量色谱峰高及半高峰宽,色谱峰峰面积可按峰高(h)和半高峰宽(b)的乘积计算。

图10所示的峰形,两色谱峰交点位于小峰半峰高以上,可采用谷-谷切割,由交点Y作基线的垂线,将两色谱峰分开,然后可用积分仪测量由该垂线分开的两个色谱峰的峰面积。用此方法测量峰面积,当两色谱峰峰高(或峰面积)不等时,小峰峰面积测量的相对误差将随大峰与小峰的峰高(或峰面积)比值的增大而显著增大。 

图9 两峰重叠交点低于小峰半峰高

图10 两峰重叠交点高于小峰半峰高

随着电子信息科学的发展以及计算机应用的普及,绝大部分色谱仪都配备了积分仪色谱数据处理机——色谱工作站,使色谱峰高和峰面积的测量变得相对简单,同时减少了峰高和峰面积的测量误差,提高了仪器的自动化程度。根据需要,人们可预先设定积分参数(半峰宽、峰高和最小峰面积等)和基线,仪器根据这些参数来计算每个色谱峰的峰高和峰面积,并直接给出峰高和峰面积的结果,以便于定量计算使用。但当计算机无法正确识别一个完整的色谱峰,以至于计算结果出错时,也需要人为地正确调整色谱峰的起落点,增加或删除色谱峰,以保证结果的准确性。

色谱图上基本的定量数据是峰面积和峰高,色谱定量分析的基础是得到的峰面积(或峰高)和进样量呈函数关系。因此在定量分析时,必须得到峰面积(或峰高)的数据,其测量的准确程度将直接影响定量结果的准确度,峰面积测定需根据不同的色谱峰形采用不同的测量计算方法。峰高和峰面积均可以在HPLC中作为定量依据,对于近似对称的色谱峰,计算峰高要比计算峰面积优越得多。

对于一定的样品,如果操作条件保持不变,在一定的进样量范围内,半高峰宽基本不变,峰高可直接代表组分的浓度。由峰高代替峰面积计算,方法快速、简便,适用于固定不变的常规分析。与使用面积定量法比较,对于出峰早的组分由于半高峰宽很小,相对测量误差大,这时用峰高定量更准确。对于出峰晚、峰较宽的组分,用峰面积定量更准确。检测器的响应值受多种因素的影响,且这些因素对峰高和峰面积的影响并非一致,表1中对不同因素的影响极其定量方法的选择作了系统总结。

表1 色谱参数变化与定量方法选择

①峰形严重拖尾。