实验室分析方法--液相色谱的定量方法—定量方法

峰高和峰面积测量仅是对检测信号的一种响应该响应需同组分的浓度或者质量结合方可完成定量方法。无论在相同的还是不同的色谱条件下进行的试验,均要采取一定的手段加以校正,才可能得到准确的定量结果。主成分自身对照法、峰面积归化、内标法、外标法及标准加入法是HPLC定量分析中常用的校正技术。

不加校正因子的主成分自身对照法是最简单的定量方法,也可以认为是峰面积归一化法的特殊形式,其使用前提是假定杂质与主成分的响应因子基本相同一般情况下,如杂质与主成分的分子结构相似,响应因子将不会有太大差别。峰面积归一化法简便快捷,但因各杂质与主成分响应因子不一定相同、杂质量与主成分量不一定在同一线性范围内、仪器对微量杂质和常量主成分的积分精度及准确度不相同等因素,所以在质量标准中采用有一定的局限性。

已知杂质对主成分的相对响应因子在0.9～1.1范围内时,可以用主成分的自身对照法计算含量。超出0.9～1.1范围时,宜用杂质对照品法计算含量,也可用加校正因子的主成分自身对照法。理想的定量方法为已知杂质对照品法与未知杂质不加校正因子的主成分自身对照法两者的结合。研究人员可根据实际情况选用合适的定量方法。

1.归一化法

对色谱图中所有色谱峰进行积分后得出总的峰面积,每个峰在总面积中所占的百分数可视为归一化峰面积。这种方法经常被用作确定杂质或次要组成在纯物质中的含量。

把所有出峰的组分(混合物中各组分)含量之和按100%计,计算其中某一组分含量百分数的定量方法,称为归一化法。此方法要求欲测样品中各组分均能流出色谱柱,并在检测器上都能独立产生信号,其中组分i的质量分数可按式(1)计算:

(1)

式中,A_i为组分i的峰面积;f_i为组分i的质量校正因子。当f_i为摩尔校正因子或体积校正因子时,所得结果分别为组分i的摩尔百分含量或体积百分数。

若样品中的组分为同系物或同分异构体,校正因子近似相等,可不用引入校正因子,将峰面积或峰高直接利用归一化公式计算:

(2)

高效液相色谱中通常使用的检测器均为紫外荧光检测器等选择性检测器,它们对不同结构化合物的响应值差别较大,有时甚至可以相差几个数量级,对成分复杂的样品分析而言,采用归一化法定量显然不可行。示差折光或蒸发光散射(ELS)检测器等通用型检测器对许多化合物有相似的响应,因此可以采用峰面积归一化法定量。只含有UV响应相似化合物的样品也可以采用这种方法定量。实际上,在无法得到标准品的情况下,采用归一化峰面积方法进行定量分析相当方便,尽管可能不很准确。

归一化法的优点是简便、准确,进样量、流速、柱温等条件的变化对定量结果的影响很小。归一化法也存在诸多缺陷,首先校正因子的测定较为麻烦,虽然一些校正因子可以从文献中查到或经过理论计算求得,但要得到准确的校正因子,还需要用每一组分的基准物质直接测定;再者必须所有组分都出峰,且重叠色谱峰影响峰面积的测量。因此方法的应用受到一定程度的限制,在使用选择性检测器时,一般不用该法。

2.外标校正法

外标法是以被测组分的纯晶(或已知其含量的标样)作为标准品进行对比定量的一种方法。取一定量标准品(即一定量已知浓度的溶液)在给定的色谱条件下注入色谱柱,并由测器测定其响应值(峰面积或峰高)。在一定浓度范围内,标样量与响应值之间一般有比较好的正比例关系:

(3)

式中,A₀为峰面积;V₀为注入的标样溶液体积;C₀为标样溶液浓度;系数f₀可由实验测得。 

在完全相同的色谱条件下,如果未知样品的进样量为V₁,实验测得的与标样相同组分的峰面积为A₁,根据式(3),由已知的A₀、V₀和c₀等即能求出样品中该种组分的相对浓度c₁: 

(4)

对一种新样品的高效液相色谱方法发展,或者仪器系统较为稳定的常规分析,一般需要采用外标作出校正曲线,并进一步进行定量校正。标准曲线法首先采用欲测组分的标准样品绘制标准工作曲线,如图1所示。

图1 外标法校正曲线

用标准样品配制成不同浓度的标准系列,在与分析欲测组分相同的色谱条件下,进行等体积进样,作出峰面积对浓度的工作曲线。理论上,此标准工作曲线应是通过原点的直线。若测定法方法存在系统误差,标准工作曲线不通过原点。标准工作曲线的斜率即为绝对校正因子。在图1中,样品1和样品2对应的浓度分别为1.5mg/ml和24mg/ml。从理论上讲,截距为零的校正曲线只需一个标样即可确定,但在实际工作中一般使用两个或更多个浓度的标准溶液。标准溶液的浓度应当与未知样浓度接近色谱法在线性范围内一般均能提供较好的响应与浓度的线性关系。对浓度较大的样品,作适当稀释,使之范围落入线性范围是一种很好的选择。

在测定样品中的组分含量时,应该在与绘制标准工作曲线完全相同的色谱条件下,注射相同量或已知量的试样进行色谱分析,得到色谱图,测量色谱峰的峰面积或峰高,根据校正曲线或响应因子,结合式(3)和式(4)可以求出其浓度值。 

标准曲线法的优点是:绘制好标准工作曲线后测定工作操作简单,计算方便,可直接从第标准工作曲线上读出含量,特别适合于大批量样品分析。

标准曲线法的缺点是:仪器和操作条件对分析结果的影响很大,要求分析组分与其他组篇分完全分离、色谱分析条件也必须严格一致;而且标准物的色谱纯度要求高(或用准确知道浓度的标准物,配置浓度时进行折算);标准曲线法属于绝对定量法,标准工作曲线绘制时,一般使用欲测组分的标准样品(或已知准确含量的样品),因此对样品前处理过程中欲测组分的变化无法进行补偿。因为在样品分析过程中,色谱条件(检测器的响应性能、柱温度、流动相流速及组成、进样量、柱效等)很难严格保证完全相同,因此容易出现较大误差,故标准工作曲线使用一段时间后应当采用标准物质及时进行校正。

对不需要大量制备的样品而言,外标法非常有效外标法由于方法操作和计算都比较简单,因此在液相色谱定量分析中经常被采用。但是这种方法对操作条件的稳定性要求较高,如检测器灵敏度、流动相流速组成等不能有太大变化。为了使溶液浓度保持恒定,要求标样及被测溶液被很好地密封,并且每次进样体积要有好的重复性,否则将会影响到定量结果的准确性。液相色谱自动进样器的进样精度一般优于0.5%,这对大多数分析来说已足够。如采用手工(注射器)操作,精密度要相对差一些,常需要配合其他校正技术。

外标法是实验室最常用的定量方法,定量结果准确,它具有如下特点:不需所有的峰都流出或被检测到,只对目标组分作校正;需要标准样品;进样量必须准确;仪器必须有良好的稳定性。

当被测试样中各组分浓度变化范围不大时,可不必绘制多点的标准曲线,而用单点校正法(比较法)。即配制一个和被测组分含量接近的标准溶液,定量进样,根据被测组分和外标组分峰面积比或峰高比计算被测组分的含量。使用单点校正法需注意的是:当方法存在较大的系统误差时,该法的误差较大。

3.内标校正法

向样品和校正溶液中加内标物是另一种校正技术。内标是不同于待测组分但能与待测组分完全分离的纯物质,选择的内标物还应当具有与待测组分相似的性质。当样品中有几种被测组分时,要求内标物的保留值介于几种组分之间,还需避免与其他组分峰重叠。

适宜的内标物需满足以下要求:化学结构与待测组分相似(同系物、异构体);不存在于待测样品中:不与样品组分发生任何化学反应;保留值与待测组分相近;浓度(响应值)与待测组分相当;与其他组分分离良好,但不能相距太远;理化性质与待测组分相似,有相似分离萃取性质。内标法定量的具体操作步骤如下。

①先用分析天平准确称取被测组分a的标样W_a(g),再称取内标物W_s(g),并加入一定量的溶剂将其溶解,如此得到的溶液作为混合标样使用。取一定体积混合标样注入色谱柱,得到的被测组分及内标物色谱峰的峰面积分别为A_a和A_s,相对响应值为:

(5)

值得注意的是,式(5)中W_a、W_s分别是混合标样溶液中所含有的总的被测组分a及内标物的绝对质量。内标法校正曲线如图2所示。

图2 内标法校正曲线

 ②称取含a组分的被测物W(g),另准确称取内标物Ws’(g),将两者混合并用一定量溶剂配制成混合溶液。取一定体积混合样品注入色谱柱,可得被测组分及内标物的色谱峰面积分别为为Aa’和As’,则被测样品中目标组分的响应值:

(6)

(7)

组分a在被测样品中的含量:

(8)

如果被测样品中除a组分外,还有b、c、d等其他组分,均可按此方法,先分别求得每种组分的响应值,然后再进一步求得组分在样品中的含量。与外标校正类似,采用单点校正偏差较大,通常需要在不同浓度的样品溶液中加入相同浓度的内标物配制成校正液,然后做出校正曲线。并进一步确定样品中的目标组分含量。

内标法能够补偿由于仪器波动造成的样品体积或浓度的改变。使用内标的一个很重要的原因在于样品有时需要繁杂的预处理或制备样品处理包括反应(衍生)、过滤、萃取等,这些步骤均会导致样品的损失,而在样品处理前加入合理选择的内标物能够校正这些损失。此外,内标法定量操作过程中将样品和内标物混在一起注入色谱柱,进样体积的不重复对峰面积所造成的影响可以在计算过程中被抵消,因此只要混合溶液中被测组分与内标物量的比值恒定,溶剂体积的变化就不会影响定量结果。

要求内标物与样品中所有组分均完全分离或许比较苛刻,对简单的混合物可能并不太难,但对复杂样品来说很难达到,此时使用内标物也许并不实际。内标法的精密度次于外标法,因为内标要求对两个峰的结果同时加以测定,而外标仅需一个峰。此外,选择一种与其他峰无任何干扰的内标物也增加了方法的复杂性,因此内标法仅用在要求制备大量样品方面,大多数常规分析采用外标法或许更适宜。

内标法的优点:使用时没有归一化法的那些限制可以抵消色谱条件(如柱温、载气流速、桥电流和进样量)、进样量不够准确等原因带来的定量分析误差,特别是在样品前处理(如浓缩、萃取、衍生化等)前加入内标物,然后再进行前处理时,可部分补偿欲测组分在样品前处理时的损失。内标法是以待测组分和内标物的峰高比或峰面积比求算试样含量的方法。内标法可以分为校正曲线法、内标一点法(内标对比法)、内标二点法及校正因子法。

内标法的缺点:选择合适的内标物比较困难,内标物的称量要准确,操作复杂,且必须事先测得相对校正因子;同时加入内标物之后在分离条件上比原样品要求更高一些(要求被测组分、内标物与其他组分都能分离)。

4.标准加入法

标准加入法也叫叠加比较法,是一种特殊的内标法。在选择不到合适的内标物时,以样品中已有组分作内标物,将该组分纯物质加入到待测样品中,然后在相同的色谱条件下,比较加入欲测组分纯物质前后欲测组分的峰面积(或峰高),从而计算出欲测组分在样品中的含量。 

图3 标准加入法定量

(a)未知样品的色谱分离谱图;(b)加入内标物后的色谱分离谱图(此图以组分2为内标物)

标准加入法测定多组分样品时,可选择样品中任一组分的纯物质作为内标物(选择样品中含量小的组分)进行定量分析。具体步骤是:首先将样品进行色谱分析,得到色谱图,然后同内标法,称取样品m(g),加入作为内标物的组分m_i(g),在相同的色谱操作条件下进行试验,得到对应的色谱图。由图3中的两张色谱图可知原样品中组分i(组分2)的色谱峰面积分别为A₂,原样品中加入标准物后的色谱峰面积分别为A'₂,然后按内标法计算出组分i(组分2)的定量结果。根据图3(a),有:

(9) 

同样,由图3(b),有:

(10)

结合式(9)和式(10),得到组分i的计算公式

(11)

式中,wi为样品中组分i的含量,

标准加入法的特点:进样量不必十分精确,操作简便,不需另外的标准物质作内标物,且更利于色谱分离;在样品前处理前加入已知量的内标物组分,可避免在前处理过程中欲测组分的损失对定量结果的影响。为保护结果的准确性,要求两次进样量必须完全相同,并要求两次色谱条件完全相同以保证校正因子完全相等。

5.痕量组分定量分析方法

HPLC是分析各种类型样品中痕量组分(≤0.01%)的一种有效技术。HPLC分析痕量组分的优势有:高分离能力,适合准确定量;较好的灵敏度和选择性;某些样品的预处理简单;可以对原始样品预富集以提高灵敏度。痕量分析的目的不同于混合物中主成分的定量检测,需要解决的问题是测定混合物中一种或几种组分的微量浓度。痕量分析的主要目的在于准确求出痕量组分的浓度,由于本身低浓度的限制,通常只要求精密度在5%～15%范围内。

通常情况下,样品无需预处理可以直接注入HPC柱中,然而有时痕量组分在分析之前必须经过固相萃取、液液萃取、过滤、组合柱和柱后反冲等处理步骤,以使其浓度达到可以检测的范围,或去除一些可能影响分离、检测的组分。样品中经常含有中性、碱性和酸性组分,以及疏水性较强的物质,样品预处理能有选择性地去除某些组分而保留所需组分此外样品的预处理也可用来改善分析的准确度。

为最大限度地消除干扰并得到最佳的准确度痕量组分峰必须与邻近峰完全分开。两峰靠得很近且痕量组分峰较主成分先流出时,测量结果较精确。相反地,痕量组分峰在主成分峰拖尾的边缘上洗脱时,精确定量将很困难。

痕量分析通常采用等度洗脱的分离模式,这样可以得到较好的检测基线和保留时间重现性。痕量组分的定量分析常采用峰高定量法。这种方法受峰重叠影响较小(准确度最好)且具有足够的精密度。在痕量分析中为得到最好的灵敏度,一般尽可能加大进样量。假若样品量有限,使用较小内径的色谱柱可以有效提高检测灵敏度。

痕量分析外标校正法:大多数痕量组分的校正均是在样品基体(如血清)中进行的。在空白(无分析物的基体)溶液中加入校正标准物,并进行正常的样品制备。校正范围应该包含样品中待测物的浓度,且不应与样品中待测痕量组分浓度相差太多。在精心设计的痕量分析方法中,校正曲线应该能外延至纵坐标的零点。如果外延至零点以下,说明在分离中已有部分样品损失。如果校正线外延至零点以上,说明基线干扰或样品中的其他组分产生干扰。

在痕量分析中一般需要样品的预处理过程(萃取、固相萃取等),为确保足够的准确度,对大多数系统分析物的绝对回收率至少为75%。当回收率太低或不稳定时,适当的内标能改善痕量分析的精度。假若空白样品无法得到也可采用标准加入法。

标准加入法通过往样品基体中加入不同质量的待测物,并分别测出样品的响应值,用响应值对加入的待测物浓度作图,然后将直线外延至与横坐标相交所对应的值即是样品中待测物的浓度(图4)。

图4 标准加入法对废水中痕量五氯苯(PCP)的定量分析