1. DMEM或1640基础培养基、PEG溶液置于37℃水浴中预温；
2. 将Balb/c小鼠摘眼球处死后，浸入75%洒精；
3. 无菌取免疫小鼠的脾脏；
4. 脾脏用PBS洗涤后，放入无菌过滤的网筛，再把网筛放在盛有完全培养基的玻璃平皿中用研磨棒（或注射器针管）轻轻研磨或挤压，使其通过网筛；
5. 将培养皿中的细胞悬液吸出，放入离心管中，1200rpm/min，离心5min；
6. 收集2×10^7个生长良好的SP2/0细胞，与1×10^8个脾脏细胞混合于透明塑料离心管中；
7. 用RPMI1640洗涤混合细胞两遍，1000rpm离心8min后，弃尽上清并用手指弹击管底，使两种细胞充分混匀成糊状；
8. 将塑料管置于37℃保温杯中，吸取1ml经37℃预温的50%的PEG溶液，将吸管轻轻插入细胞底部，在1min内匀速加完，且边加边轻轻搅拌；
9. 在水浴中静置90s，再加入40ml 37℃预温的DMEM基础培养基，室温静止5min后离心（1000rpm×10min），弃去上清；
10. 将沉淀细胞轻轻用40ml含1%HAT、15%FCS的DMEM培养悬浮。混匀后滴加在上述含有滋养细胞的96孔培养板中，100µl/孔，置于37℃、5%CO2培养箱中培养；
11. 3~4d后半量换液，10d后改用HT培养基培养，2周后转用含15%FCS（胎牛血清）的DMEM培养基培养。
12. 培养结束后，显微镜观察融合细胞。
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