近年尽管新的抗真菌药物不断问世，肺曲霉感染临床死亡率仍较高［1］肺曲霉球（aspergilloma）是肺曲 霉病的一种常见类型［2］本研究组成功治疗1例不产孢烟曲霉白化株所致的肺曲霉球，同时结合相关文献 对该菌株引起的临床及实验室特点进行分析。
对象和方法
一、临床资料
患者女，76岁。因右侧胸痛3个月就诊。患者2012年9月无明显诱因出现右侧胸痛，约位于季肋
部，为阵发性针刺样疼痛，未予重视及治疗。2012年 10月患者右季肋部疼痛较前加重，于当地医院胸部
CT示右肺占位，予阿莫西林克拉维酸钾加左氧氟沙 星抗感染治疗1周，疼痛无明显缓解，且右肺占位性
质不明。2012年11月转至南京某医院行CT引导下 经皮肺穿刺，病理见上皮细胞及大量炎细胞，穿刺组
织培养见白色绒毛状致密菌落，真菌G试验（1，3⁃β⁃D
葡聚糖抗原）、半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）试验正常，同时请我院协助鉴别分离菌株，并于2012年
11月26日于我院住院治疗，再次行肺穿刺术。患者 30岁左右患肺结核，抗结核治疗后诉治愈（具体不 详）；48岁时因咯血诊断为肺囊肿，予对症治疗后好 转（具体不详）；50岁左右患胸膜炎。有高血压病10余 年，现口服复方硫酸双肼屈嗪，血压控制良好。 体检：神清，全身浅表淋巴结未触及肿大及压痛。右下肺呼吸音低，叩诊呈实音，触觉语颤增强， 听诊两肺呼吸音粗，未闻及干湿性啰音。 辅助检查：血常规、肝肾功能、血糖无异常，血
癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）、糖类抗原无异
常；体液免疫包括 IgA 2 290 mg/L，IgG 13.0 g/L， IgE 40.0 IU/ml，IgM 1 130 mg/L，C3 1
160 mg/L，C4 322 mg/L；细胞免疫包括CD3+62.0%，CD4+ 31.0%， CD8+ 27.0%，CD4+/CD8+
1.15，B细胞15.0%，NK细胞17.0%，均在正常范围。真菌G试验（< 10）、GM试验 均正常（<
0.5），抗结核抗体阴性，隐球菌乳胶凝集 试验阴性。胸部CT示：右肺下叶背段一约4.8 cm × 3.0
cm团块状密度增高影，其内可见环形透光影及 钙化灶，壁厚薄不均。可见一支气管与病灶及右侧 肺门相连。见图1A。
二、真菌学检查及菌种鉴定
1. 真菌培养：取患者肺穿刺组织及外院分离菌株接种于含有放线菌酮及氯霉素和仅含氯霉素的
沙堡培养基（SDA）上。并置于25 ℃和37 ℃条件下
培养，同时进行药物敏感试验。2.分子生物学测序鉴定：2次肺穿刺分离菌株进行PCR检测，共检测3次，用Biopsin真菌基因组
DNA提取试剂盒（杭州博日科技有限公司）按照说 明提取菌株DNA，PCR扩增获取菌的ITS区。其体 系及流程如下，PCR体系（50
μl）：DNA样本1 μl，无 核酶纯水22 μl，上下游引物（10 mmol/L）各1 μl，2 × Go Taq Green⋯Master
Mix 25 μl。使用真菌通用引 物：ITS（internal transcribed
spacer）15′⁃TCCGTAGGTGAACCTGCGG⁃3′和 ITS4 5′⁃TCCTCCGCTTATTGAT
ATGC⁃3′。Partial β微管蛋白特异引物benA⁃F（5′⁃
AATTGGTGCCGCTTTCTGG⁃3′）和benA⁃R（5′⁃AGTT GTCGGGACGGAATAG⁃3′）。PCR反应条件为95 ℃
变性10 min；94 ℃变性30 s；55 ℃退火40 s；72 ℃延 伸1 min；循环35次，72 ℃终末延伸7 min。4 ℃储存
备用。
三、药物敏感试验
由于本菌株完全不产生孢子，无法进行孢子计数定量，需定量时采用打孔法保证菌丝块面积的一 致性，用接种针将致病菌接种到YAG固体平板上， 37 ℃培养2 d，打孔后倒放于YAG固体药平板中央。 药平板的药物浓度分别为伊曲康唑2、4、8、16、32 mg/L， 伏立康唑0.125、0.25、0.5、1、2 mg/L，两性霉素B 4、8、 16、32、64 mg/L。将接种好的菌平板置于37 ℃恒温 培养箱中培养3 d后，从平板地面量取菌落直径，为 避免接种面积对结果的影响，将各药平板上的菌落 直径与不加药物的相应菌株直径均减去5 mm后的 差值比较各种药对菌生长的相对抑制程度。
四、构建种系发生树
NCBI中选取烟曲霉复合体及其近源菌种的β微管蛋白及ITS序列及β微管序列保存于txt文本中，利 用MEGA7.0软件构建系统发生树，Phylogeny选用 Construct/Test Neighbor⁃Joining Tree 法，Bootstrap 验 证值为1 000。
图1 患者胸部CT 1A：右肺下叶背段见一4.8 cm × 3.0 cm团块状密度增高
影，其内可见环形透光影及钙化灶，壁厚薄不均；1B：伊曲康唑治疗1个月后，右 肺下叶背段病灶较前缩小急慢性炎症伴纤维组织明显增生及玻璃 样变，另可见多量菌丝（图3A）；PAS染色 （图3B）、PAM染色阳性（图3C）。
结 果
一、真菌培养
2次穿刺组织在SDA培养基上，37 ℃生长较快，4 d后形成圆形菌落，表面呈白色绒毛状致密菌落， 中央略高起，表面可见皱褶或放射状纹（图2A），背 面呈淡黄色（图2B）。小培养见较丰富的分枝分隔 菌丝，菌丝体类顶囊样结构，可见极少量无色素分 生孢子，呈类圆形（图2C），次代分离株在 SDA、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、 CDA（CzapekDoxAgar）、CA（CzapekMedium） 等多种培养基中菌落与亲代相同，小培养 仅见丰富的分支分隔菌丝，未见孢子 产生。
二、组织病理
右肺穿刺组织HE染色，示黏膜轻度急慢性炎症伴纤维组织明显增生及玻璃 样变，另可见多量菌丝（图3A）；PAS染色 （图3B）、PAM染色阳性（图3C）。
三、分子生物学鉴定
3次PCR产物所得分离菌株的保守区序列与基因库中烟曲霉的对应序列 99%一致（GenBank aceession no. KX098468.NCBI）。β微管蛋白所得产 物测序与烟曲霉 99%一致（GenBank aceession no. DQ438548.1，NCBI）。该菌种序列资料已经上传 GenBank 并 获 得 序 列 号（BankIt1908552 Seq1 KX098468）。MEGA7.0构建的种系发生树与烟曲霉（Aspergillus fumigatus）具有高度同源性（图4、5）。
四、药物敏感试验
伊曲康唑最低抑菌浓度（MIC）≤ 32 mg/L，伏立康唑≤2 mg/L，两性霉素B≤64 mg/L（打孔法），均为敏感。
五、诊断
烟曲霉所致肺曲霉球。
六、治疗
伊曲康唑注射液0.5 g/d静脉滴注治疗2 d，患者出院后口服伊曲康唑口服液20 ml日2次，1个月后 复查胸部CT提示病灶较前缩小（图1B）。由于患者 胃肠道反应较大，改为伏立康唑 0.2 g 口服每隔 12 h 1次，治疗后2个月复查CT，病灶吸收明显。随 访至今患者病情无反复。
图2 肺穿刺组织真 2A 2B 2C菌培养 2A：沙堡培养见 表面呈绒毛状白色致密 菌落，中央略高起，表面 可见皱褶或放射状纹，呈 白色；2B：MEA培养基上 的菌落形态；2C：小培养 见较丰富的分枝分隔菌 丝，菌丝体上可见极少量 孢子，呈无色透明类圆形
图3 右肺穿刺组织病理 黏膜轻度急慢性炎症伴纤维组织明显增生及玻璃样变，可见多量分隔菌丝，并见呈45°角双分支菌丝（箭头）。 3A：HE × 400；3B：PAS × 400；3C：PAM × 400
讨 论
肺曲霉病（pulmonary aspergillosis，PA）是由曲霉属感染或吸入曲霉属病原体引起的一组急慢性 肺部病变，其中以烟曲霉最为常见，约占90%。肺曲霉球是肺曲霉病的一种较常见类型，属于寄生型 曲霉。本例患者根据临床表现、胸部CT、穿刺组织病理、真菌学检查及分子生物学鉴定，最终确诊 肺曲霉球，同时其临床及分离菌种均具有特殊性。 首先，患者有基础性肺疾病：肺曲霉球主要是外源 性感染，多为曲霉入侵或植入肺内原有疾患形成的 空洞或空腔内，在腔内继发生长，其菌丝、孢子和黏 液纤维、炎症形成曲霉球，同时由于烟曲霉本身的 特性如烟曲霉分布广泛，生长迅速，其孢子体积较 小（3 ~ 5 μm），可以沉积于肺脏远端。该患者既往 有肺结核、肺囊肿、胸膜炎等慢性肺部疾病史，虽然 胸部CT显示无陈旧病灶，但是不排除原有基础肺疾 病在曲霉定植中起到一定的作用。第二，缺乏PA 的先决条件即该患者免疫功能正常，同时缺乏曲霉 接触史。肺曲霉病多因职业因素，长期暴露于存在 大量曲霉孢子的环境中，如处理动物皮毛、晒谷和 饲养鸽子等，当吸入的曲霉孢子超出机体防御能力 时，便会引起爆发性肺部感染。该患者缺乏职业暴 露史，同时否认长期系统应用抗生素、糖皮质激素 及免疫抑制剂史，辅助检查显示患者的体液免疫及 细胞免疫状况正常。第三，临床病程长，预后好。 肺曲霉球患者的预后主要与基础疾病的自然病程 及严重性有关。Limper等分析该病预后不良的危险因素包括严重的肺部基础疾病，曲霉球数量和体 积，免疫缺陷状态等。目前关于该病的最佳治疗方 法还未达成共识，多数学者认为手术是最佳治疗方案。该患者病程长达3个月，同时年龄较大，经2个 月的抗真菌治疗后临床症状及影像学检查均显著 改善，预后较好。我们认为除了与患者免疫功能正 常相关外，同时也可能与该临床分离株特性（即不 产黑素及产孢子少）密切相关，此分离菌株在37 ℃ 培养条件下，经多种培养基（包括SDA、PDA、CDA、 CA）等培养21 d后仍未见色素产生，镜下无产孢。 烟曲霉标准菌株的分生孢子为烟绿色，主要存在于 细 胞 壁 ，包 含 一 种 色 素 称 为 二 羟 基 萘（dihydroxynaphtalene，DHN），这种黑素能够保护菌 种抵抗紫外线辐射、酶裂解、活性氧、高热等。黑素除了保护烟曲霉抵抗宿主防御外，同时是分生孢 子细胞壁基本成分，因此黑素在烟曲霉的致病过 程中起到重要的作用。本临床分离株表现出产孢贫瘠，次代分离株在多种培养基中无产孢，亦无色 素产生。分析该菌株的RNA⁃Seq数据发现，参与烟 曲霉DHN⁃黑色合成相关基因pksP/alb1、ayg1、arp2、 arp1、abr1和abr2较正常菌株均显著下调，同时在动物试验中证实，该菌株毒力低于烟曲霉标准株 Af293Kocho等，提示其致病力较标准株下降。Jahn 和 曾诱导ALB1基因突变获得烟曲霉白化株，通过小鼠模型试验发现，其致病力显著降低。 第四，2次真菌G试验、GM试验阴性。GM试验对于 曲霉病的早期诊断具有重要价值，但多个研究表 明，血清GM对非粒细胞缺乏、非器官移植的肺曲霉 病患者的诊断价值较低。Park等发现，血清GM诊断曲霉球的敏感性仅38%，合并咯血患者敏感性 52%，而无咯血患者敏感性仅9%。
临床分离株菌种特性：主要包含2个方面：①菌落形态不同，传统的菌落形态为烟绿色，经久培养 后变为深绿色、烟绿色，而该分离株菌落在多种培 养基中均为致密白色绒毛状；②镜下形态不同，传 统的烟曲霉镜下可见典型曲霉头结构包括顶囊、分 生孢子梗、大量圆形分生孢子等，而该患者肺穿刺 组织临床分离株未见典型顶囊，仅有较丰富的分枝 分隔菌丝及极少量类圆形无色透明孢子，由于该菌 形态结构的非典型性，通过真菌通用引物3次扩增 测序鉴定均为烟曲霉，利用产孢少的烟曲霉特异性 引物β微管蛋白引物扩增也与烟曲霉一致。高露娟等曾对我国大陆地区报道的1 457例曲霉病例进行综述，发现培养阳性的481例中仅258例进行了 菌种鉴定，仅4例提供了分子生物学鉴定依据，提示 在曲霉病的诊断中需要重视形态学及分子学检 测。本实验组分离所得烟曲霉菌株曾经被考虑是 否为烟曲霉的有性阶段，但是其菌种形态及镜下结 构并不随时间延长有所改变。Katz等曾经研究烟曲霉临床分离株的基因变异情况，对4株孢子生成 贫瘠的非典型烟曲霉进行分子分析，通过临床分离 株的碱性蛋白酶基因DNA序列分析，发现每个菌株 在遗传上均不同，同时每个菌株表现出与烟曲霉核 苷酸序列7% ~ 11%的差异。随后的形态学研究表 明 ，所 有 菌 株 都 可 以 被 规 划 为 Aspergillus viridinutans，但是它们的菌落形态主要表现为蓝绿 色，与本菌菌落形态有本质区别，本菌株除了形态 学不同于标准株外，分子学鉴定有99%的一致性。 Katz等曾为了弄清4个非典型分离株的分类，检测了非典型菌株的部分 β 微管蛋白序列和 18S rRNA基因序列，发现所有非典型菌株都包含独特 的β微管蛋白序列，具有较低水平的DNA序列变 异，同时非典型分离株的18S rRNA基因在单个核苷 酸位点上亦不同于烟曲霉。高露娟等也曾对125例患者的162株烟曲霉复合体菌株通过形态学及分子 生物学测序进行鉴定，所有烟曲霉复合体菌株均为 经典烟曲霉，未检出烟曲霉相关新种，同时所有菌 株生长形态及光镜下产孢结构均较典型。本研究 检测该临床分离株的β微管蛋白序列，与标准株具 有99%的一致性，有别于既往报道的非典型烟曲 霉，目前已将该临床分离株命名为A1J，同时已对其 生长特性、致病力及药物敏感试验及动物实验等多 方面进行了研究。
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