寡核苷酸探针还有一个重要用途。在用于检测单个碱基差异时尚可采用一种称为寡核苷酸限制（oligonucleotiderestriction）的技术。
该技术只有在突变点位于某一限制性内切酶识别位点时才有效。例如，镰刀状红细胞贫血是因β珠蛋白基因的第6个寡码子由GAG变成GTG，从而导致所编码氨基酸由酪氨酸变成缬氨酸。突变的β-珠蛋白功能异常，称作S珠蛋白，而野生型称为A珠蛋白，其基因型分别为βS和βA。恰好突变点A→T位于DelI的识别序列CT－NAG之内，这就为设计寡核苷酸限制实验创造了条件。方法是合成一个长40个碱基的寡核苷酸探针，其5’末端距突变碱基有11个碱基，该探针与βA基因的非编码链互补。将此探针的5’末端标记上32P。
杂交方法采用液相杂交法，即在液相中将靶DNA变性解链，然后与探针退火，产生杂交体。如靶DNA为βA型，则两条链完全互补，并产生DdeI的酶切位点；如待检DNA为βS型，则所形成的杂交体中两条链在突变碱基处不配对，从而不能被DelI所识别。用DelI消化杂交DNA，显然βA会被切开而βS不被切开。
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