甲氨蝶呤高效液相色谱法测定

(R)-甲氨蝶呤

照高效液相色谱法（通则0512）测定。

供试品溶液：取本品，加流动相溶解并稀释制成每1mL中约含0.2mg的溶液。

对照溶液：精密量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。

系统适用性溶液：取消旋甲氨蝶呤，加流动相溶解并稀释制成每1mL中约含40µg的溶液。

色谱条件：用牛血清白蛋白键合硅胶为填充剂，以正丙醇-磷酸盐缓冲液（pH6.9）（取0.71%无水磷酸氢二钠溶液500mL，加0.69%磷酸二氢钠溶液600mL，摇匀，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.9）（8: 92）为流动相，检测波长为302nm，进样体积20μL。

系统适用性要求：系统适用性溶液色谱图中，出峰顺序依次为(S)-甲氨蝶呤峰与(R)-甲氨蝶呤峰，其分离度应大于3.0。

测定法：精密琵取供试品溶液与对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

限度：供试品溶液色谱图中如有(R)-甲氨蝶呤峰，其峰面积不得大于对照溶液主峰面积的3倍（3.0%）。

有关物质

照高效液相色谱法（通则0512）测定。

供试品溶液：取本品，加流动相溶解并稀释制成每1mL中含1mg的溶液。

对照溶液：精密屈取供试品溶液1mL，置200mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。

系统适用性溶液：分别取甲氨蝶呤与叶酸，用流动相溶解并稀释制成每1mL中各约含0.1mg的混合溶液。

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-7.0%枸橼酸溶液-2.0％无水磷酸氢二钠溶液（8.5:10:80）（用7.0％枸橼酸溶液或2.0%无水磷酸氢二钠溶液调节pH值至6.0）为流动相，检测波长为302nm，系统适用性溶液进样体积10µL，其他溶液进样体积50µL。

系统适用性要求：系统适用性溶液色谱图中，理论板数按甲氨蝶呤峰计算不低于1000，甲氨蝶呤峰与叶酸峰之间的分离度应大于8.0。

测定法：精密量取供试品溶液与对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的4倍。

限度：供试品溶液色谱图中如有杂质峰，单个杂质的峰面积不得大于对照溶液的主峰面积（0.5%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的4倍（2.0%）。

水分

取本品，照水分测定法（通则0832第一法1）测定，含水分不得过12.0%。

炽灼残渣

取本品1.0g，依法检查（通则0841），遗留残渣不得过0.1%。

重金属

取本品0.50g，加25%硫酸镁的硫酸溶液（取硫酸镁25g，加1mol/L硫酸溶液100mL使溶解）4mL，摇匀，置水浴上蒸发至干，于800°C缓缓炽灼至完全炭化，炽灼时间不超过2小时，放冷，依法检查（通则0821第二法），含重金属不得过百万分之五十。