cccDNA的定量检测

在定性检测的基础上，可以进一步对cccDNA进行定量检测。仍以PCR定量分析技术中，尤其是竞争PCR技术的敏感性和精确度高。方法是在PCR反应管中加入一种已知量的、能与野生模板等效扩增的内参照，内参照是经过突变处理的，其两端尤其是引物退火区的序列与野生模板相同。PCR扩增后通过一定的方法将野生片段与突变片段区分开，分别计算其绝对量，或求出其相对比值，就可以推算PCR扩增以前野生模板的量。

He等建立了实时荧光定量PCR检测cccDNA的方法。他们将TaqmanMGB探针设计在负链缺刻的下游，与负链互补结合。对cccDNA，在上游引物的引导下，Taq酶到达TaqmanMGB探针所结合的位点，利用其5’→3’外切活性将探针切断，3’端的淬灭基团失去对5’端的发光基团的抑制作用，从而产生荧光信号。每扩增一个cccDNA分子，就会产生一个荧光信号，PCR仪可对产生的信号进行实时监测，根据荧光信号的强弱对cccDNA进行定量。对rcDNA，由于上游引物引发的链延伸不能通过负链缺刻，故不能使TaqmanMGB探针被Taq酶切断产生荧光信号。该方法的特异性比选择性PCR进一步提高，可以消除高rcDNA背景可能产生的非特异性扩增。该方法的检测低限可达100个拷贝，灵敏度比应用的任何一种其它方法都高。所有检测在2小时内可完成。

还有其他一些更为敏感的检测方法，如Shao等报告的两步法对cccDNA进行实时荧光定量。其设计与He等的方法有异曲同工之处，即都是利用rcDNA与cccDNA分子结构上是否完整来有效地将二者区分开来，实现对cccDNA的特异性检测。该方法在荧光探针位置的选择上更符合荧光PCR的要求，即探针越靠近引物效果越好，这样检测到的荧光信号质量和实时扩增曲线形状可能更佳，而在He等的方法中探针与上游引物点之间的距离则至少需要在230个碱基以上。但是，该方法存在与套式PCR类似的缺点，即需要分两步操作，单链延伸反应管开盖后极有可能造成产物污染。