贝类毒素及其检测方法

　　1 蓝藻/海洋毒素简介

　　 蓝藻/海洋毒素是依据来源划分的一类毒素，主要由淡水或海水中的浮游藻类合成，并在鱼虾贝类等生物体内蓄积，通过食物链危害生物及人类安全。

　　2 贝类毒素简介

　　贝类通过滤食有毒微藻（主要是藻黄素）， 经过生物积累和放大转化为有机毒素， 即贝类毒素。在常见海洋生物毒素中，以贝类毒素造成的危害性最大，范围最广，根据中毒症状及毒素传递类型， 可将常见的海洋贝类毒素分为四种，分别是： 麻痹性贝类毒素（PSP）、 腹泻性贝类毒素(DSP) 、 神经性贝类毒素（NSP）、失忆性贝类毒素（ASP）

　　2.1 腹泻性贝类毒素

　　 腹泻性贝类毒素是海洋中藻类产生的一类脂溶性次生代谢产物， 因被人食用后产生以腹泻为特征的中毒效应而得名。贝类滤食后在其体内性质非常稳定， 一般的烹调加热不能使其破坏。人类误食会产生以腹泻为主要特征的中毒症状， 严重者可出现黄疸、 急性萎缩性肝坏死， 长期毒性效应可能导致癌症。 目前尚无特效解毒剂。常见的于尖螺 、青蛤 、海螺 、沙螺 、香螺 、毛蛤 、泥螺 、花蛤 、白蛤 、文蛤 、扇贝 、海瓜子 、单双头美人蛏 、竹节蛏 、 海红 、 赤贝 、袋 18、牡蛎等贝类海鲜中 ， 我国国家标准GB5009. 212 -2016中明确规定了大田软海绵酸、2 鳍藻毒素 -1、鳍藻毒素 -2 的测定方法。国内的限量值为0.05MU/g。

　　2.2 神经性贝类毒素

　　 神经性贝类毒素主要是因贝类摄食短裸甲藻后在体内蓄积， 人类一旦食用这些染毒贝类

　　便会引起以麻痹为主要特征的食物中毒， 或在赤潮区吸入含有有毒藻类的气雾， 会引起气喘、咳嗽、 呼吸困难等中毒症状而得名。 神经性贝类毒素是贝类毒素中唯一的可以通过吸入导致中毒的毒素。神经性贝毒是到目前为止危害范围较小的一类毒素。神 经 性 贝 类 毒 素 主 要 来 自 于 短 裸 甲 藻 (Ptychodisus brevis) 、 剧 毒 冈 比 甲 藻(Gambierdiscums toxin-cus) 等藻类。 神经性贝类毒素属于高度脂溶性毒素， 结构为多环聚醚化合物， 主要为短裸甲藻毒素。 神经性贝类毒素的毒理与麻痹性毒素相似， 作用于钠通道，作用位点与石房蛤毒素不同。 引起钠通道维持开放状态， 从而引起钠离子内流， 造成神经细胞膜去极化。在贝类生鲜制品、冷冻贝类制品、贝类罐头、贝类肉干制品中都有其身影。GB5009. 261 -2016中 用小鼠生物法对短裸甲藻毒素进行测定。

　　2.3 记忆缺失性贝类毒素

　　 记忆缺失性贝类毒素是一种强烈的神经毒性物质， 因可导致记忆功能的长久性损害而得名。 中毒者表现出肠道症状和神经紊乱， 严重的有短暂的记忆丧失现象。 ASP 直到 1987 年才被现，其引起中毒的成份是软骨藻酸 (DA) 。 它是一种强烈的神经毒性非蛋白氨基酸， 能导致短期记忆功能长久损害， 半数致死量（LD50） 为 10g/kg. 这些藻类主要生长在美国、 加拿大、新西兰等海域。 在日本海域的微藻 Chondria armata 也可导致健忘性贝类毒素的发生。欧盟对其设定的限量值为2000μg/kg（以DA计）。

　　2.4 麻痹性贝类毒素

　　 麻痹性贝类毒素（PSP)因人食用了含这种毒素的贝类后会引起以外周神经肌肉系统麻痹为初始症状的中毒效应而得名，是目前已知贝类毒素中分布最广、毒性最强、 对人类威胁最严重的毒素。 这种毒素有 20 种以上的天然衍生物。 PSP 毒性强， 其毒性是眼镜蛇毒性的 80 倍， 对人的经口致死量 为0. 84~ 0. 9mg。 在国际条约中已被列为化学武器。 目前还没有针对麻痹性贝类中毒的特效解毒剂， 因此人类摄入超过一定限量的 PSP 时， 其病死率达 100%。 PSP 最常见的生物是蛤和贻贝。 偶尔也出现于布氏海菊蛤、 扇贝和牡蛎。其中主要的制毒成分为麻痹性贝类毒素 GTX1 ,4 、GTX2 , 3 、dcGTX2 , 3 、GTX5 、neoSTX 、STX 、dcSTX。麻痹性贝毒是一类神经肌肉麻痹剂， 对人体的作用机理主要是阻断细胞钠离子通道。 造成神经系统传输障碍而产生麻痹作用。误食了含有麻痹性毒素的贝类后， 中毒症状是从嘴唇周围发生轻微剌痛和麻木感， 发展到全身麻痹，并由于呼吸障碍而死亡。轻度嘴唇周围有剌痛感和麻木感逐步扩大到面部和颈部手指尖和脚趾的针剌感觉， 可有头痛、 眩晕和恶心。 中度语无伦次， 剌痛感发展至手臂和腿四肢强直和肢体失调， 身衰弱和眩晕， 轻度呼吸困难， 脉搏加快。 重度肌肉麻痹， 明显地呼吸困难， 窒息感， 在没有呼吸机护理的条件下可能死亡。在国内限量值为4MU/g。

　　3. 贝类毒素的检测方法

　　贝类毒素检测方法有哪些呢？

　　 目前，经过验证的检测方法有免疫化学法， 小白鼠生物，检实验法高效液相色谱法，液相色谱  -串联质谱法，分光光度法和电泳检测法。国家检测标准（如GB5009. 198-2016、GB5009. 212-2016、GB5009. 213 -2016、GB5009. 198-2016等）中所涉及的 麻痹性贝类毒素（PSP）、 腹泻性贝类毒素(DSP) 、 神经性贝类毒素（NSP）、失忆性贝类毒素（ASP）的标准方法包括：小鼠生物法、酶联免疫吸附法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法。其中应用较多的为酶联免疫法和液相色谱串联质谱法。

　　3.1 酶联免疫试剂盒( 免疫化学法）

　　 免疫分析技术分为酶联免疫吸附试验（ELISA）。 放射免疫分析（RIA） 和血球凝聚等，最常用的是酶联免疫检测方法。酶联免疫检测方法操作方便快速，成本低，适合处理大批量样品，且无需配备昂贵仪器，近年来在分析化学领域得到迅速发展。酶联免疫竞争法是基于抗原抗体特异性结合的原理，在酶标板微孔上预包被贝类毒素抗原，待检样品中的贝类毒素抗原与包被的抗原竞争性结合酶标记贝类毒素抗体，没有被结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去，结合的酶标记物将无色的显色剂转化为蓝色的产物。 加入终止液后颜色由蓝色变为黄色，通过酶标仪测量吸光度值（OD值），样本吸光值与其含有的贝类毒素的量呈负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中贝类毒素的含量。

　　 3.2 液相色谱  -串联质谱法

　　 液相色谱－串联质谱法综合了色谱的分离能力以及质谱的定性功能，可同时定性、定量分析多种毒素成分，并可以鉴别新毒素的结构特征。此法灵敏度高，尤其是在分析低浓度毒素样品上具有突出优势，是海洋生物毒素监测分析的热点方法。其在用于测定中失忆性贝类毒素时结合固相萃取柱、或者免疫亲和柱使用时其方法的检出限为可以达到0.005μg/g ,腹泻性贝类毒、麻痹性贝类毒素、都可用用液相色谱串联质谱法测定，其检出限都可以达到10~25μg/kg。质谱检测的优势在于，可以同时进行多毒素同时分析，检测效率高。但也因前处理采用固相萃取住，样品净化能力优先，造成基质干扰。如果结合更具有专一性的免疫亲和柱，势必会对质谱检测起到主力作用。

　　4. 普瑞邦贝类毒素解决方案

　　 4.1 试剂盒快检方法

　　 对于麻痹性贝类毒素（PSP）、 腹泻性贝类毒素(DSP) 、 神经性贝类毒素（NSP）、失忆性贝类毒素（ASP）、我司都有其对应的酶联免疫检测试剂盒，符合国标要求。 针对 贝肉、贝类消化腺、藻类等样品中的贝类毒素。

　　以腹泻性贝类毒素例

　　 样品加入提取液涡旋后稀释点孔，前处理简单便捷。定量范围为50-4050 μg/kg，孵育全过程为45min，且完全符合国标附录C商品化试剂盒评价技术参数中规定的重现性和交叉反应率要求。

　　 我司实验室在市场上随机采购新鲜扇贝、钉螺、花蛤、牡蛎，去壳后用去离子水清洗，均质粉碎制样检测，结果均为阴性，未检出麻痹性贝类毒素。且加标麻痹性贝类毒素20ppb及200ppb，结果回收良好。表明(本次购买)附近市场贝类海鲜未受到海洋毒素污染且试剂盒满足麻痹性贝类毒素检测要求。

　　 样品经液质方法确证，阴性复合率100%。

　　4.2 液相色谱-柱后衍生法

　　MDS-柱后衍生应用于PSP检测的仪器方法是国标《GB5009. 213 -2016食品安全国家标准

　　贝类中麻痹性贝类毒素的测定》中指定的检测方法。其衍生原理是PSP在碱性条件下氧化再酸化能生成荧光性物质。经我司技术人员多次方法开发，开发了多功能光电衍生系统（MDS）结合高高效液相色谱仪使用、能用一种缓冲溶液作为流动相，在C18反相色谱柱上分离，采用梯度改变流动相的比例和流速，一次进样可同时定性及定量分析待测试样中的GTX、STX、dcSTX、neoSTX等麻痹性贝类毒素组分。 MDS能够有效提高待测物质的荧光效应、或者让其产生荧光效应，提高检测的灵敏度。

　　其衍生原理如下图。

　　分析条件为：

　　色谱柱：Pribolab生物毒素分析专用柱C8（4.6*250mm，5μm）

　　液相流速：0.8ml/min

　　流动相A：配制11mM庚烷磺酸钠和5.5nM磷酸溶液，用氨水调节PH至7.1。

　　流动相B：乙腈

　　荧光检测器：λex=330nm，λem=390nm

　　多功能光电衍生系统MDS条件：

　　流速：0.4mL/min

　　衍生温度：85℃

　　氧化剂：配制5mM高碘酸和100mM磷酸溶液，用5M氢氧化钠调节pH至7.8。

　　酸化剂：750mM硝酸

常见10种麻痹性贝类毒素柱后衍生-液相色谱图

　　4.3 液相色谱-串联质谱法

　　液相色谱－串联质谱法综合了色谱的分离能力以及质谱的定性功能，可同时定性、定量分析多种毒素成分，并可以鉴别新毒素的结构特征。此法灵敏度高，尤其是在分析低浓度毒素样品上具有突出优势，是海洋生物毒素监测分析的热点方法。

　　Pribolab技术应用研发中心在充分借鉴国标方法和国家疾控系统的国家食品污染和有害因素风险监测工作手册方法，优化部分参数和前处理方法，部分样品的检测采用PriboFast®麻痹性贝类毒素(PSP)免疫亲和柱代替HLB固相萃取柱进行样品净化，因免疫亲和柱具有的特异性功能，使得试样净化效果更佳，检测结果更为准确有效。

　　样品经提取，稀释后过免疫亲和柱，经过柱、淋洗、洗脱三个步骤得到净化、浓缩后的待测液：

　　经验证，该方法在泥螺、扇贝样品中做加标回收验证，准确性在80%-110%之间。

　　此外Pribolab自主研发的海洋毒素15N同位素内标，采用三重纯化技术保证产品纯度，能够有效的校正基质效应及各毒素间的相互影响，提高检测的准确度和精密度。

　　常见11种麻痹性贝类毒素标准溶液的多反应检测色谱图

　　 针对各个检测我司都有着对对应的检测所需标准物质，服务于液相色谱、液相色谱串联质谱等检测方式。也可提供标准品定制服务（大浓度、多成分的液标混标）此外Pribolab自主研发的海洋毒素15N同位素内标，采用三重纯化技术保证产品纯度，能够有效的校正基质效应及各毒素间的相互影响，提高检测的准确度和精密度。

　　 4.4 海洋毒素质控样

　　 基于贝类基质的基质复杂、油脂含量大等问题。致使实验室在测定其中的海洋毒素时准确度难以保障。可靠的质控样品，能够为方法验证提供有力工具。而贝类的阳性样品一来难以获得，二来将普通样品制备成均一性、稳定性要求都极高的质控样也存在很多困难。为了更好的监控整个实验过程，提升检验检测能力，我司研发已菲律宾蛤仔肉中海洋毒素质控样品、蛤蜊肉中海洋毒素质控样品。

其他贝类毒素试剂盒订购信息：

　　普瑞邦始终致力于生物毒素全套解决方案研究，力求实现一站式的产品和服务供应，为广大科研、实验工作者提供便利和保障。

2023年遨游系列专题——生物毒素检测技术及应用