酶消化法
胰酶消化法
胰蛋白酶消化法
实验方法原理 | 大鼠星形胶质细胞原代培养后,作胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色鉴定,应用缺氧D-Hanks'液及缺氧培养罐行OGD后用台盼蓝染色及乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测细胞损伤程度。 |
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实验材料 | Wistar大鼠乳鼠 |
试剂、试剂盒 | FBS DMEM 胰蛋白酶 EDTA 酒精 |
仪器、耗材 | 眼科剪 滴管 离心机 培养皿 CO2培养箱 |
实验步骤 |
一、实验步骤
1. 新生1-2 天Wistar大鼠乳鼠,经75%酒精消毒,断头处死。
2. 取脑放入冷的D-Hanks'平衡盐溶液,去除脑膜及大血管。
3. 分离两侧大脑皮质并剪成1mm3 大小,加入0.25%胰蛋白酶37℃空气浴震荡消化10 min。
4. 用含10% FBS的DMEM培养基终止消化,离心(1 000 rpm,10 min),去上清。
5. 用含10% FBS的DMEM培养基重悬沉淀,经75μm筛网过滤,收集滤液,再次离心10 min,收集沉淀用含10% FBS的DMEM培养基重悬,调整细胞密度至1.5x106/ml,种植于75 cm2 培养瓶。
6. 经1 小时差速黏附去除成纤维细胞后,将细胞悬液转移到一新的75 cm2 培养瓶继续培养,两天换液一次。
7. 7 天后将培养瓶放入水平摇床(260 rpm,2 h,37℃),换液弃除小胶质细胞,放入培养箱平衡1 小时,重新置于水平摇床18 h。
8. 换液弃除少突胶质细胞,用新鲜培养基洗2 遍,加入0.25%胰蛋白酶与0.02% EDTA 1:1 混合液消化、传代备用。
二、 形态学观察
三、 细胞生长曲线绘制
四、星型胶质细胞的鉴定 五、结果 图1:星型胶质细胞形成融合状,单层生长(x200) 2. 鉴定:细胞经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色98%以上均为细胞浆着色,而胞核未见着色,见下图,证明采用上述方法获得的细胞为星型胶质细胞,纯度高, 可用于实验。
图2:免疫组化鉴定,GFAP 染色
图3:细胞生长曲线
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