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大鼠星型胶质细胞培养可以:(1)用于神经系统发育、分化及再生等基础研究;(2)脑缺血预处理上调神经保护蛋白的机制研究;(3)脑损伤和脑疼痛的研究;(4)新蛋白的功能研究。
酶消化法
胰酶消化法
胰蛋白酶消化法
大鼠胚胎
L-15培养基 胶原酶 Dnase D-MEM-BS FCS-DMEM 阿糖胞苷
离心机 水浴锅 培养瓶 培养箱
一、分离大鼠胚胎(16-18周)新皮层,置于L-15(或Hank’s平衡盐/DMEM溶液,无Hepes)培养基中,除去脑膜和血管、海马、尾核和其他非皮层组织。二、 用解剖刀将其切成1 mm3大小的组织块。三、用1ml枪头转移250 μl胶原酶储存液(1.33%,溶于L-15中)到1ml的L-15(或D-MEM)中。每2只鼠脑组织块使用1-1.5 ml稀释胶原酶液。四、37℃水浴中孵育30 min。五、1 000 rpm(大约230g)中离心5 min,或3 000 rpm(大约2 000 g)中离心1 min。六、去上清。七、在含EDTA-CMF的溶液中重悬细胞,并与胰蛋白酶以1:4~1:10比例混合。可以根据观察到的细胞消化的情况,适当调整两者的比例。八、加入胰蛋白酶的抑制剂和DNase溶液,混合5分钟。九、1 000 rpm(大约230 g)中离心5 min,或3 000 rpm(大约2 000 g)中离心1 min。十、去上清。加入500 μl D-MEM-BS。十一、轻轻吹打成单细胞悬液,开始用5 ml枪头吹打10次,在需要时用18-gauge的针头吹打。( 注意:不要产生气泡。)200目/300目尼龙网过滤。十二、将细胞转移到含10%FCS-DMEM的培养瓶中,培养密度为2X106/25 cm2培养瓶,4~6 X106/75 cm3培养瓶。在37.2℃,37.5%中培养。十三、第2天换液,以后每隔3天换液。十四、7-10天,细胞发生融合。十五、细胞融合后,将瓶盖用封口膜密封好,在轨迹摇床上培养,旋转速度以不产生气泡为宜。37℃振摇过夜。细胞注意避光。十六、去上清,加入新鲜10%FCS-DMEM。十七、加入200 μl 1 mM的阿糖胞苷/10 ml培养基。在37.2℃,37.5%中培养孵育48小时以消除分裂的细胞。十八、换用新鲜10%FCS-DMEM,孵育恢复24小时。十九、重复17-18步骤,消除所有的分裂细胞