试剂、试剂盒 GSP-RT 引物poly(A)+RNA 或总 RNA反转录缓冲液 RNA 酶 HRNasinSuperScriptII 逆转录酶dNTP 溶液DTTTECoCl2dATP 溶液脱氧核苷酸末端转移酶加尾缓冲液 HerculesHot-Start 聚合酶HerculesHot-Start 聚合酶缓冲液5'末端加尾的 cDNA 库寡核苷酸引物
仪器、耗材 热循环仪水浴或加热仪Microcon-100 过滤器
实验步骤
第 1 阶段：反转录产生 cDNA 模板
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
dNTP 溶液（含 4 种 dNTP，各 10mmol/L)
DTT(0.lmt)l/L)
TE(10mmol/LTris-HCl、pH7.5,1 mmol/LEDTA、pH8.0)
2. 酶和缓冲液
反转录缓冲液，5X(制造商提供）
RNA 酶 H
RNasin
SuperScriptII 逆转录酶（Invitrogen)
3. 核酸和寡核苷酸
GSP-RT 引物（100ng/ul)
poly(A)+RNA 或总 RNA
4. 特殊设备
预设为 37°C、42°C、50°C、70°C、80°C 的水浴或加热仪
二、方法
1. 在一个无菌的离心管中，于冰浴上混合以下转录成分。
反转录缓冲液，5X 4ul
dNTP 溶液（含 4 种 dNTP, 各 10 mmol/L) 1ul
DTT(0.lmol/L) 2ul
RNasin(40U/ul) 0.25ul
2. 在另一个管中，混合 0.5ul 的 GSP-RT 引物（100ng/ul) 和 lug poly(A)+RNA 或5ug 总 RNA，再加 13ulH20。80°C 温育 3 min, 迅速在冰上冷却，在离心机中离心 5s。
3. 将 RNA/引物混合物加入到反转录成分中，然后加 1ul(200U) 的 SuperscriptII 逆转录酶，温和混匀，42°C 保温 1h，然后 50°C 保温 10min。
4.70°C 溫育 15 min，使逆转录酶失活，然后离心 5s。
5. 加入 0.75ul(1.5U) 的 RNA 酶 H 到管中，37°C 温育 20 min, 以破坏 RNA 模板。
6. 用 TE 将反应混合物稀释至 40ul，4°C 保存（这就是 5'末端无尾 cDNA 文库）。
第 2 阶段：在第一链 cDNA 产物末端加 poly(A) 尾
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
CoCl2(25 mmol/L)
dATP 溶液（1mmol/L)
TE(10 mmolTris-HCl、pH7.5，1mmol/LEDTA、pH8.0)
2. 酶和酶缓冲液
脱氧核苷酸末端转移酶（Tdt)
加尾缓冲液，5X(125 mmol/LTris-HCl、pH6.6，lmol/L 二甲胂酸钾，1250ug/ml BSA)
3. 特殊设备
Microcon-100 过滤器（Millipore) 或起相同作用的其他产品
预设为 37°C、65°C 的水浴或加热仪
二、方法
1. 用 Microcon-100 过滤器（Millipore) 或起相同作用的其他产品，去除 5'末端无尾cDNA 文库（由上面第 1 阶段第 2 步得到）中的过量引物，按说明进行操作，并用 TE 洗两次以上，总体积不要超过 15ul，用水将总体积调整至 15ul。
2. 加 4ul 的 5X 加尾缓冲液和 10U 的 Tdt。
3.37°C 保温 5 min, 然后 65°C 温育 5 min。
4. 用 TE 将体积稀释至 500ul, 保存于 4°C(这就是 5'末端加尾 cDNA 文库）。
第 3 阶段：扩增
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
dNTP 溶液（含 4 种 dNTP，各 10 mmol/L)
TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5,1mmol/LEDTA、pH8.0)
2. 酶和酶缓冲液
HerculesHot-Start 聚合酶（Stratagene)
HerculesHot-Start 聚合酶缓冲液（10X)
3. 核酸和寡核苷酸
5'末端加尾的 cDNA 库（由上面第 2 阶段得到）
寡核苷酸引物 Qo、QT 和 GSPl(Q0 和 QT 的序列见图 25-2)
4. 特殊设备
可设程序的热循环仪
二、方法
1. 第一轮
(1) 在一个无菌的 0.2 ml 离心管中混合以下成分。
HerculesHot-Start 聚合酶缓冲液（10X) 5ul
dNTP 溶液（10 mmol/L) 1.0ul
Hercules Hot-Start 聚合酶 2.5U
H20 至 50ul
(2) 加 1ul 的 5'末端加尾 cDNA 文库（来自第 2 阶段第 4 步）和 GSP1,Q0[见图 25-2(b)] 和 QT 引物各 25pmol。
(3) 混匀并在 DNA 热循环仪上 98°C 加热 5 min, 使第一链产物变性，并激活聚合酶。冷却至 48°C 退火 2 min, 然后 72°C 延伸 40 min。
(4) 按下列程序进行 30 个扩增循环。
2. 第二轮
(5) 取出部分第一链扩增产物，用 TE 以 1:20 稀释。
(6) 用上面的程序，但省略掉 2 min 的退火和 72°C40 mm 的延伸步骤，用 Q1 引物和 GSP2 引物扩增 1ul 上述稀释材料。
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