试剂、试剂盒 缓冲液、溶液和试剂酶和酶缓冲液核酸和寡核苷酸
仪器、耗材 特殊设备
实验步骤
第 1 阶段：降解 RNA 的去磷酸化
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
乙酸钠，3mol/L,pH5.2
乙醇
二硫苏糖醇（DTT)（0.1mol/L)
苯酚/氯仿（1:1，体积比）
2. 酶和酶缓冲液
磷酸酶缓冲液，10X
蛋白酶 K
RNasin
牛小肠碱性磷酸酶（CIP)
3. 核酸和寡核苷酸
RNA 样品
4. 特殊设备
预设为 37°C、50°C 的水浴或加热仪
5. 其他
琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备，包括溴化乙锭
二、方法
一般来说，应该按照生产商的说明使用磷酸酶。
1.在一个无菌的离心管中混合以下成分。
RNA 50ug
10X 磷酸酶缓冲液 5ul
DTT(100 mmol/L) 0.5ul
RNasin(40U/ul) 1.25ul
CIP(lU/ul) 3.5ul
H2O 至 50ul
2.50°C 溫育 1h。
3.加蛋白酶 K 至 50ug/ml，37°C 温育 30 min。
4.用苯酚/氯仿抽提反应物，然后用氯仿再抽提一次。用 l/l0 体积的 3mol/L 乙酸钠(pH5.2) 和 2.5 倍体积的无水乙醇沉淀 RNA，用 43.6ulH20 重溶 RNA。
5.取 2ug(1.6ul) 的 RNA 跑 1% 的琼脂糖凝胶电泳（TAE)，相邻的泳道点 2ug 的原始RNA 样品，用溴化乙锭染色，以确认 RNA 在去磷酸化步骤中仍然是完整的。
第 2 阶段：完整 RNA 去帽
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
ATP(100 mmol/L)
氯仿
乙酸钠,3mol/L，pH5.2
乙醇
苯酚/氯仿 (1:1, 体积比）
TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5，lmmol/LEDTA、pH8.0)
2. 酶和酶缓冲液
RNasin
烟酸焦磷酸酶（TAP)，5U/ul
TAP 缓冲液，10X
3. 核酸和寡核苷酸
第 1 阶段所得到的 RNA 样品
4. 特殊设备
预设为 37°C 的水浴或加热仪
5. 其他
琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备，包括溴化乙锭
二、方法
1. 在一个无菌的离心管中混合以下成分。
RNA(由第 1 阶段第 5 步得到）38ul
TAP 缓冲液（10X) 5ul
RNasin(40U/ul) 1.25ul
ATP(100 mmol/L) 1ul
TAP(5U/u1) 1ul
H20 至 50ul
2.37°C 温育 1h, 然后加 200ul 的 TE。
3. 用苯酚/氯仿抽提反应物，然后用氯仿再抽提一次。用 1/10 体积的 3mol/L 乙酸钠(pH5.2) 和 2.5 倍体积的无水乙醇沉淀 RNA, 用 40ulH20 重溶 RNA。
4. 取 2ug 的 RNA 跑 1% 的琼脂糖凝胶电泳（TAE)，相邻的泳道点 2ug 的原始 RNA样品，用溴化乙锭染色，以确认 RNA 在去帽步骤中仍然是完整的。
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