第 3 阶段：RNA 寡核苷酸的制备
选择离 T7 或 T3RNA 聚合酶作用位点下游约 lOObp 处可以线性化的质粒 [见图 25-3(b)]。因为来自多克隆位点回文序列的引物用于 PCR 效果不好，因此比较理想的是用在多克隆位点克隆进某个插入片段的质粒。一个已经验证过的质粒是 pBS-SK-GBX-l-3'UTR,它是在 pBS-SK(Stratagene) 的 Sst I 位点克隆进了小鼠的 Gbx-1(Frohmanetal.1993) 基因的 3'非翻译区。它可以用 SmaI 线性化，并用 T3RNA 聚合酶转录，产生一段 132 个核苷酸的 RNA 寡核苷酸。除了 17 个寡核苷酸外，其他均来自 Gbx-1。需要注意，如果可以找到合适的酶切位点，腺苷酸是 3'末端寡核苷酸连接到靶序列 5'末端的最好的「受体」。后面扩增所用的引物都是 3'非翻译区的序列。Gbx-1 NRC 引物的序列和质粒可以向Frohman 实验室索取。要进行转录测试，以确保各种组分正常工作，然后再放大反应体系。寡核苷酸可以长期保存于-80°C 备用。由于纯化和斑点检查操作损失很大，因此合成足够的寡核苷酸是很重要的。
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
氯仿
乙醇
焦碳酸二乙酯（DEPC) 处理过的 H20
rUTP 溶液，10 mmol/L
rATP 溶液，10 mmol/L
rCTP 溶液，10 mmol/L
rGTP 溶液，10mmol/L
DTT(0.lmol/L)
苯酚/氯仿（1:1, 体积比）
乙酸纳，3mol/L，pH5.2
TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5，lmmol/LEDTA、pH8.0)
2. 酶和酶缓冲液
合适的内切酶和相应的缓冲液
胰腺 DNA 酶 I(无 RNA 酶）
蛋白酶 K
依赖 DNA 的 RNA 聚合酶
RNasin
转录缓冲液， 5X ( 由制造商提供）
3 . 核酸和寡核苷酸
质 粒 模 板 DNA
4 . 特殊设备
合 适 规 格 的 Microcon 过 滤 器（见第 7 步）
预 设 为 37°C 的水浴或加热仪
5 . 其他
琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备，包 括 溴 化 乙 锭
二、方法
1. 用合适的内切酶和缓冲液，线 性 化 25ug 的 质 粒 DNA, 以 用 于 转 录（质粒中要确保没 有 R N A 酶）。
2. 用 50ug/ m l 的 蛋 白 酶 K 于 37°C 消 化 处 理 30 min, 然后用苯酚/ 氯 仿 抽 提 两 次 ，氯仿再抽提一次。用标准的无水乙醇沉淀法收集 DNA。
3. 用 25ul 的 T E ( pH8 . 0 ) 重 溶 模 板 DNA, 其 终 浓 度 约 为 lug/ ul 。
4. 室温下，在一个灭菌的管中按下列顺序混合以下转录试剂。
37°C 温育 1h
5. 转录之后，每 20ul 反应体积加 0.5ulDNA 酶（无 RNA 酶），37°C 温育 10min，以去掉 DNA 模板。
6. 取 5ul 验证反应或制备反应的产物，跑 1% 的琼脂糖凝胶电泳（TAE)，以检測寡核苷酸产物。除在胶的上下都会有一些拖尾外，在产物的预期大小（或稍小）的位置，会有一条弥散的带。
7. 用苯酚/氯仿抽提，用氯仿再抽提，以纯化寡核苷酸。用水漂洗 3 遍，然后过 Microcon(Millipore) 过滤器（预先用水浸泡）。
Microcon30 过滤器的截留值为 60nt,Microcon100 过滤器的截留值为 300nt。如果寡核苷酸小于100nt, 则 MicroconlO 过滤器也许是最合适的。对于更大的寡核苷酸，可以用 Micrcon30 过滤器。
8. 另取一份适量的寡核苷酸样品，跑 1% 的琼脂糖凝胶电泳（TAE)，检测样品的完整性和浓度。分装后保存于-80°C。
第 4 阶段：RNA 寡核苷酸与细胞 RNA 的连接
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
ATP，2 mmol/L
2. 酶和酶缓冲液
连接缓冲液，lX(500 mmol/LTris-HCl、pH7.9，100 mmol/MgCl2，20 mmol/LDTT，1mg/mlBSA)
RNasin
T4RNA 连接酶
3. 核酸和寡核苷酸
RNA 寡核苷酸，由上面第 3 阶段制备
TAP 处理过和没有处理过的 RNA 样品
4. 特殊设备
Microcon100 过滤器
预设为 17°C 的水浴或加热仪
5. 其他
琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备，包括溴化乙锭
二、方法
1. 取两个无菌的离心管，一个加 TAP 处理过的细胞 RNA，另一个加没处理过的细胞 RNA。
连接缓冲液（10X) 3ul
RNasin(40U/ul) 0.75ul
RNA 寡核苷酸 4ug*
TAP 处理（或非处理）的 RNA 10ug
ATP(2 mmol/L) 1.5ul
T4RNA 连接酶（20U/ul) 1.5ul
H2O 至 30ul
*比目的细胞 RNA 多 3~6mol
2.17°C 过夜反应 16 h。
3. 用 Microcon100 过滤器纯化连接产物（用水洗 3 遍，过滤器预先用无 RNA 酶的水冲洗），回收体积不应超过 20ul。
4. 取 1/3 体积的连接产物，进行 1%TAE 琼脂糖凝肢电泳，以检查连接 RNA 的完整性。它应该没有多大变化。
第 5 阶段：反转录
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
dNTP 溶液（含 4 种 dNTP，各 10 mmol/L)
DTT,0.1mol/L
TE(10mmol/LTris-HCl,pH7.5,lmmol/LEDTA,pH8.0)
2. 酶和酶缓冲液
反转录缓冲液 5X(由制造商提供）
RNA 酶 H
RNasin
SuperscriptII 逆转录酶（Invitrogen)
3. 核酸和寡核苷酸
反义特异性引物（20ng/ul)，或六碱基随机引物（50ng/ul)
连接寡核苷酸的 RNA，由上面第 4 阶段制备
4. 特殊设备
预设为 37°C、42°C、50°C、70°C 的水浴或加热仪
二、方法
1. 在一个无菌离心管中，于冰浴上混合以下转录组分。
反转录缓冲液，5X 4ul
dNTP 溶液（10 mmol/L) 1ul
DTT(0.lmol/L) 2ul
RNasin(40U/ul) 0.25ul
2. 在另一个管中，将剩余的 RNA(约 6.7ug) 溶于 13ul 水中，加入 20ng 的反义特异性引物或 50ng 的六碱基随机引物，80°C 温育 3 min, 迅速在冰上冷却，在离心机中离心 5s。
3. 将 RNA/引物混合物加入到反转录组分中，然后加 1ul(200U) 的 SuperscriptII 逆转录酶，42°C 温育 lh, 然后 50°C 温育10min。如果用的是随机引物，在混合了各组分之后，加一步室温温育 10min 的反应。
4.70°C 温育 15 min，使逆转录酶失活，再离心 5s。
5. 加入 0.75ul(1.5U) 的 RNA 酶 H,37°C 温育 20 min, 以破坏 RNA 模板。
6. 用 TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5，lmmol/LEDTA) 将反应混合物稀释至100ul，4°C 保存（这就是 5'末端寡核苷酸-cDNA 文库）。
第 6 阶段：扩增
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5，lmmol/LEDTA、pH8.0)
DMSO
2. 酶和酶缓冲液
dNTP 溶液（含 4 种 dNTP, 各 10mmol/L)
Taq 聚合酶（原文缺。—译者加）
Taq 聚合酶缓冲液（10X)
3. 核酸和寡核苷酸
5'末端寡核苷酸-cDNA 文库（由第 5 阶段第 6 步得到）
寡核苷酸引物 GSP1、GSP2、NRC1 和 NRC2(NRC1 和 NRC2 引物的细节见图 25-4)
4. 特殊设备
可设程序的热循环仪
二、方法
1. 第一轮
(1) 在一个无菌的 0.2 ml 离心管中混合以下组分。
Taq 聚合酶缓冲液（10X) 5ul
dNTP 溶液（10 mmol/L) 1.0ul
DMSO 5ul
Tag 聚合酶 2.5U(原文缺。-—译者加）
H20 加至 50ul
(2) 取 5'末端寡核苷酸-cDNA 文库 1ul，加入 GSP1 和 NRC1 引物各 25pmol。
(3) 在 DNA 热循环仪上 98°C 加热 5 min, 使第一链产物变性，并激活聚合酶。冷却至合适的温度（56?68°C) 退火 2 min,72°C 延伸 40 min。
(4) 按下列程序进行 30 个（原文为 35 个。一译者改）扩增循环。
2. 第二轮
(5) 取第一轮的部分扩增产物，用 TE 以 1:20 稀释。
(6) 用上面介绍的程序，但省略掉 2 min 的退火和 72°C40 min 的延伸步骤, 用 GSP2 和NRC2 引物扩增 1ul 稀释样品。
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