中和实验-2

2 ）血清对照组（ 7 号管）
 
取 2 只 Hela 细胞培养管，弃去培养液，每支试管中加 1:20 稀释的待检血清 0.1ml ，然后送 37 ℃水浴保温 1 小时取出，于每支培养管中加入 0.9mlEagle 维持液，送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱培养。
 
3 ）细胞对照管（ 8 号管）
 
取 2 只 Hela 细胞培养管，弃去培养液，送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱培养。
3 结果

在培养第 3 ， 5 ， 7 天各观察一次，观察时将细胞培养管从温箱取出，显微镜低倍视野下观察有无 CPE （细胞病变效应），并按表记录。当细胞出现 CPE 时，可见磁暴生长减缓或停止生长，细胞变大，肿胀，甚至死亡，脱落。观察后，出现 CPE 的培养管可弃去，未出现 CPE 的培养管继续送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱培养至第 7 天。
 
中和实验 CPE 结果记录:

结果判定

1 病毒对照组均应出现 CPE 为“＋”
 
2 血清对照组和细胞对照组不应出现 CPE ，为“－”。
 
二） 中和方法实验二——用已知免疫血清鉴定病毒型别
 
1 材料

1 ） 病毒悬液：选用未知型别的脊髓灰质炎病毒 1 ： 10 稀释液 1ml 。
 
2 ）免疫血清：选用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒免疫血清（ 1 ： 5 稀释）各 0.35ml 。
 
3 ）敏感细胞：选用 Hela 细胞培养管 15 支。
 
4 ）其余材料同方法一。
 
2 方法

a 实验组实验方法
 
1 ） 取待鉴定病毒稀释液 0.75ml 分别与三型特异性免疫血清（各 0.25ml ）等量混合，在 37 ℃ 水浴 1 小时取出。
 
2 ）取 6 支 Hela 细胞培养管，弃去培养液，每支培养管中加入混合液 0.2ml ，每份混合液接种 2 支细胞培养管。接种后，培养管置 37 ℃水浴箱中水浴 1 小时取出，于每支培养管内加入 Eagle 维持液 0.8ml ，送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱培养。
 
b 实验对照组实验方法
 
1 ）病毒对照组
 
取 2 只 Hela 细胞培养管，弃去培养液，每支试管中待检病毒悬液 0.1ml ，送 37 ℃水浴保温 1 小时取出，于每支培养管中加入 0.9mlEagle 维持液，送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱培养。
 
2 ）血清对照组
 
取 6 只 Hela 细胞培养管，弃去培养液，每支试管中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型免疫血清各 0.1ml ，然后送 37 ℃水浴保温 1 小时取出，于每支培养管中加入 0.9mlEagle 维持液，送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱 培养。
 
3 结果 :

4 结果判定

1 ）方法同方法一
 
2 ）鉴定病毒。待鉴定的病毒与哪一型免疫血清的中和试验结果为阳性，即为该型病毒。
 
注意事项

1 必须选用对细胞有较稳定致病力的病毒。
 
2 灭活的血清必冷却后应用。
 
3 本试验必须要有阳性对照，阴性对照和细胞对照