整个暑假都在追奥运,今天女排大破荷兰队,闯进了决赛,我的女神好厉害,我都热泪盈眶了。
实验室
小丸子
实验室
花轮
光顾着看奥运,要开学了,你的实验都做好了吗?老板催得紧啊...
做是做了,可是His 标签蛋白纯化效果不理想,宝宝心里苦呀~~o(>_<)o ~~
实验室
小丸子
GE小编
别着急,今天GE来跟大家一起找找原因!
纯化所得组分中
为何没有重组的His标签蛋白?
本期我们想跟大家分享的一个常见问题是:纯化所得组分中没有收集到重组的His标签蛋白。该问题主要可以分为以下两个方面:
一方面
若His标签蛋白没有结合到填料上就流穿了
原因1
超声的功率不对
超声功率过高,容易导致蛋白炭化;功率过低,蛋白释放不出来。
建议:改变超声功率,同时可以在超声前加入溶菌酶。
原因2
结合缓冲液条件不合适
建议:检查结合缓冲液中是否有影响结合的因素,如:金属离子螯合剂、强还原剂、过高的咪唑浓度。pH的改变也会对结合效果有影响,可以摸索不同的pH条件,可能会收到意想不到的效果。
原因3
His标签没有表达或丢失或暴露不充分
建议1:用anti-His的抗体进行WB,检测His标签是否存在。
建议2:将蛋白用4-6M盐酸胍或4-8M尿素变性后,让His标签充分暴露出来,看是否能与填料结合。
建议3:改变His标签的位置或者增加其数目(常用6-10个His),增加暴露和结合机会。
建议4:改变金属结合离子,除了Ni2+,Cu2+、Zn2+、Co2+也可以用来进行His标签的捕获。
另一
方面
若His标签蛋白结合了,但是洗脱不充分
原因1
洗脱条件太温和
建议:增加咪唑的浓度或选择咪唑线性梯度洗脱,或者通过降低pH寻找最佳洗脱条件。需要注意的是,pH低于3.5容易导致镍离子脱落。
原因2
蛋白柱上沉淀
建议1:降低蛋白浓度。可以减少上样量,或者采用咪唑线性而非步级梯度洗脱,增加蛋白稀释度。
建议2:使用去污剂或者改变NaCl的浓度,或者使用变性剂(4-6M盐酸胍或4-8M尿素)在变性条件下洗脱。
原因3
非特异性的疏水或者其他相互作用
建议:加入非离子型去污剂到洗脱缓冲液(如:2% Triton X-100)或增加NaCl的浓度洗脱。
下期预告
以上,是小编为大家寻找的一些可能的原因,也欢迎大家来信分享你们的纯化小经验。下期,我们将会继续与大家分享His标签蛋白纯化小贴士(二),期待您的关注。
GE小编
要开学了,哥才不会告诉你我家的His标签蛋白纯化产品正在火热促销,