景杰学术 | 报道
肝脏内皮细胞（liver endothelial cells，L-EC）是肝脏中除了肝实质细胞外一类重要的细胞。有研究报道，L-EC不仅可以作为“过滤器”调节从肠道到肝细胞的代谢物运输，还可以通过不依赖于白细胞外渗的方式控制对病毒感染的免疫反应，这表明了L-EC在肝实质的空间组织和维持肝脏稳态方面具有指导作用 [1] 。
近年来的研究加深了我们对L-EC功能的了解，单细胞测序技术的应用，使得沿着肝小叶轴从门静脉到中央静脉的肝细胞和L-EC转录组的异质性和复杂性得到解析。但目前针对空间信号机制的研究仅限于单细胞转录组学（scRNA-seq），这并不能反映出蛋白质组、包括翻译后修饰组等蛋白质的功能和最终生物学结果的调控作用。
2021年5月25日，Development Cell杂志上发表了题为“ A spatial vascular transcriptomic, proteomic, and phosphoproteomic atlas unveils an angiocrine Tie–Wnt signaling axis in the liver ” 的最新文章，该研究将空间细胞分选与转录组学、蛋白质组学和磷酸化修饰组学相结合，建立了肝脏内皮细胞的空间蛋白质组全景，并进一步揭示Tie1信号依赖性Wnt的产生是维持肝脏再生生态位和损伤后肝脏质量恢复的关键决定因素，为肝脏分区的血管信号传导机制提供了新的启发和深入理解。
01
肝脏内皮细胞的空间多组学分析
前期分析发现cKit（原癌基因C-kit编码的III型受体酪氨酸激酶家族成员）表达沿门静脉中央肝小叶轴逐渐增加。于是，研究人员基于 cKit表达强度对L-EC进行FACS分类，得到门静脉（portal node，PN）、门静脉周围（peri-portal，PP）、中央周围 （peri-central，PC）和中央静脉 （central vein，CV）四个亚群。接着，通过转录组、蛋白组和磷酸化修饰组分析，分别鉴定到28727个基因、5015个蛋白质和位于3447个蛋白质上的19607个磷酸化位点。通过比较四个亚群的差异表达，明确了所有L-EC转录本、数千种蛋白质以及相应磷酸化位点的分区模式，在空间上建立了一幅全面的关于血管床蛋白表达和磷酸化的多组学分布图。
图1. 肝脏内皮的空间多组学
02
肝脏血管的空间磷酸化修饰组
研究人员对Ⅰ类p-肽（p-S, p-T和 p-Y磷酸化肽段）的空间分布进行分析，发现25%鉴定到的肽段有明显的分区，这与蛋白质总体分区一致。对比7520对p-肽-蛋白质的CoM（Center-of-Mass），研究人员发现16%的p-肽-蛋白质对发生显著的分区变化，而在蛋白质- RNA对中这一比例为8%，这表明沿着肝窦的差异磷酸化是调节蛋白质功能的主要因素。SMART 蛋白结构域分析显示，酪氨酸激酶催化结构域在中心区域显著富集，而丝氨酸/苏氨酸催化结构域在各个区域的表现相同。
图2. 空间蛋白质组学揭示了肝脏血管的不同磷酸化
03
受体酪氨酸激酶Tie1特异性调控Wnt9b的表达
当激活单个血管RTKs（receptor tyrosine kinase）时，血管生成素受体Tie1和Tie2/TEK在TOP分区的磷酸化蛋白中被鉴定出来，但它们的mRNA和蛋白质水平相同，这表明该信号途径的高度局部化激活，可能在肝脏分区中具有调控作用。研究人员使用Tie1功能阻断抗体进行了通路阻断实验，结果显示L-EC转录组在CV中发生了显著变化。与此同时，CV标志性基因Wnt9b几乎完全不表达，因此，研究人员将Tie受体信号确定为血管Wnt表达的关键调节因子，Wnt9b的直接转录调控由Tie1信号传导介导，并且Wnt9b表达的调控对Tie受体信号传导具有高度特异性。
图3. 酪氨酸激酶Tie1信号传导介导Wnt9b的转录调控
04
Tie1诱导的Wnt是肝脏再生所必需的
由于Tie1特异性调控L-EC Wnt9b的表达，研究人员着重研究了这条信号轴对肝再生的贡献。通过条件性灭活EC中的Tie1（Tie1iECKO），然后在三分之二部分肝切除术 (PHx) 后追踪肝脏再生。结果显示，肝切除两天后，与对照小鼠相比，肝切除小鼠肝脏裂解物中Wnt9b和Wnt2的表达显著降低。此外，术后2天的肝体比显著降低，肝脏再生受到损害，这表明Tie1信号依赖性Wnt的产生是维持肝脏再生生态位和损伤后肝脏质量恢复的关键决定因素。
图4. Tie1诱导的Wnt是肝脏再生所必需的
总之，本研究通过空间细胞分选策略，从肝小叶不同区域富集L-EC，结合转录组学、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析，绘制了肝脏血管系统中蛋白质调节的结构解析的草图。结果进一步揭示，Tie受体信号是血管Wnt活性的选择性和特异性调节因子，协调血管分泌素信号，从而在肝再生过程中控制肝细胞功能。
本研究对肝脏细胞的空间组织形成了基础性的见解，也为其他器官的空间生物学研究提供了启发。空间分选可作为一种普遍适用的策略，结合高灵敏、高深度的单细胞蛋白质组学（single-cell proteomics），将为生物系统中细胞异质性研究、精细蛋白分子图谱构建、空间蛋白质网络分析等提供最本质的精准信息，为肿瘤异质性、干细胞分化、生殖细胞发育等提供新的思路和见解。
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参考文献：
[1] Guidotti L, et al., 2015. Immunosurveillance of the liver by intravascular effector CD8+ T cells. Cell.
[2] Inverso D, et al., 2021. A spatial vascular transcriptomic, proteomic, and phosphoproteomic atlas unveils an angiocrine Tie–Wnt signaling axis in the liver. Developmental Cell.
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