在药物开发阶段，准确迅速地确定新型生物蛋白的氨基酸序列和修饰正变得越来越重要。在强制降解试验和稳定性评价过程中，生物蛋白和多肽可能因化学降解而产生结构不同而分子量相同的氨基酸或修饰。一种棘手的情况是遇到立体异构化（如外消旋化、L/D型氨基酸替换），它常常发生在储存稳定性测试中，而且由于不同异构体可能在色谱分析中共洗脱且在MS/MS中会产生不唯一的碎片，因此鉴别难度很大。
LC-MS方法在现代生物制药领域应用广泛，是完整蛋白质量鉴别和肽图分析的常规方法。离子淌度(IM)基于离子大小和形状的差异在漂移管中产生漂移时间差来实现第四维度的分离，补充传统质谱所不能获取的特异性信息。有研究发现通过比较子离子的漂移时间(DT)偏移，成功定位了氨基酸序列中的异构修饰位点，但研究者表示，常规IM的分离性能在某些情况下不足以区分肽的D/L型差向异构体，需要高分辨率IM仪器[1]。
近期，诺和诺德公司和沃特世公司的科学家们基于沃特世最新款SELECT SERIES Cyclic IMS高端离子淌度质谱共同发表研究成果，提出了一种创新策略，它结合液相色谱与高分辨率离子淌度质谱系统，基于迁移率和质量来区分肽和肽碎片。今天小编与大家分享该方法的一些思路和结果。
图1. 诺和诺德公司结合液相色谱与高分辨率离子淌度质谱系统的肽与肽碎片研究策略示意图
实验设计模拟目前蛋白质或肽类药物发现和开发过程中难分析的消旋化氨基酸，设计并合成了一系列异构肽。这些肽含有一系列单位点特异性修饰，包括D型和L型对映体（表1）。
表1. 用于本次研究的含消旋化氨基酸的异构肽及对照品
分离异构肽混合物
在常规UPLC 45s的保留时间窗口内，11种肽发生了明显的共洗脱。使用R≈20的常规IMS QTof分析11种肽，从运行的结果中提取保留时间(RT)及IM的DT和半峰宽数据。使用Mathematica软件处理数据并在共有二维空间中绘图，在R=20情况下运行11种肽的混合物时的结果(图2A)。模拟软件计算表明，在R=120时，肽混合物在RT-DT空间内能够充分分离(图2B)。基于cIM设备的R以大约65√n的比例缩放（其中n是离子通过次数），可预测n>3足以分离肽混合物。很重要的一点是，n=4时，IM分离时间约为50s，仍与前端UPLC兼容。图2C为 UPLC-cIMn=4-MS 实验数据，这些数据与软件预测十分吻合。LC分离中共洗脱的物质在DT维度下分离良好，这清楚地证明了高分辨率cIM的优势。
图2. 合成肽混合物DT-RT二维图谱：(A)低IM分辨率(R~20)条件下的模拟二维图；(B)优化IM分辨率后(R~120)的模拟二维图；(C)环形离子淌度通过4圈分离的UPLC-cyclic IMS实验数据(cIMn=4，R~130)。
表征异构修饰位点
尽管分离和定量这些修饰肽对生物制药科学家很有助益，鉴别和精准定位氨基酸(AA)修饰位点才是他们的终极目标。对于非异构肽修饰，传统方法是将肽的碎片离子质荷比(m/z)与参比肽的碎片离子质荷比相比较，确定目标碎片离子的m/z偏移是否在一定范围内。异构修饰可采用类似的方法分析，但需要比较异构肽碎片离子的DT与非异构肽序列碎片离子的DT，而不是比较m/z。利用Cyclic IMS的碎裂能力扩展前述方法可鉴别和精准定位氨基酸(AA)修饰位点。通过四极杆筛选母离子，随后在捕获室中实施碰撞诱导解离(CID)，然后运行cIMn=4-MS，采集每种异构肽的主要b离子和y离子的数据。可观察到两种不同异构肽之间存在漂移时间偏移，如图3所示，modPep1两种b4碎片离子到达时间可观察到0.45 ms的差异。这些碎片离子到达时间分布(ATD)相对偏移可用于定位肽序列中的异构修饰。
图3. 参比肽(HLSDSR, 红色线)与modPep1(HLSDSR, 绿色线)的碎片离子到达时间分布对比，上图为y碎片离子的迹线，下图为b碎片离子的迹线(cIMn=4)。
对于单修饰肽(modPep1-8)，基于b离子数据可正确鉴别出八种肽中的五种，基于y离子数据正确鉴别出八种肽中的七种。需要注意的是，IM不能分离含有单一手性位点的碎片离子。因此，尽管modPep7的y1碎片包含修饰，但它不能用作IM诊断离子。在其他情况下，序列中的氨基酸D/L型可引入（足以造成DT偏移的）构象差异，这在大部分情况下（碎片离子残基数量在两个以上）都能观察到。在modPep2的b2碎片中，D/L诱导的构象变化也不足以造成DT偏移，推测b2碎片离子带有难分离的恶唑酮结构。另一个无法基于b、y离子确认的异构序列是modPep3。由于在CID裂解中形成环（琥珀酸）酸酐的天冬氨酸效应，带天冬氨酸/异天冬氨酸(isoAsp)C端的b离子碎片结构相同，无法用IM区分。对于这个特别的案例，由于强大的Cyclic IMS可实现CID（碰撞诱导解离）、ECD（电子捕获解离）和SID（表面诱导解离）三种不同模式的碎裂方式，可以灵活使用ECD模式根据异天冬氨酸会在± m/z 57处生成的诊断性碎片离子为结构确证提供了依据。令人鼓舞的是，双修饰肽的数据看上去很有希望(modPep9和modPep10)，结合b离子和y离子数据可以限定修饰所在的内部残基范围。如前文所述，这里描述的方法还可应用于其他异构和相同分子量的氨基酸修饰，包括区分亮氨酸和异亮氨酸。
表2. 修饰肽碎片离子DT相对于参比肽碎片离子DT的偏移百分比。为了设定DT重现性基准和设置鉴别阈值，评估了18次重复实验中（分两天完成）RefPep子离子DT的相对标准偏差（第一行数据），同时列出了平均值(AvgRSD=0.12)。以2倍AvgRSD为阈值评估修饰肽的DT偏移百分比 — 超出阈值的以红色高亮显示。
图4. SELECT SERIES Cyclic IMS高端离子淌度质谱创新性的硬件设计。
图5. 沃特世不断超越的高分辨淌度质谱技术（该图展示的样品为某反向序列的五肽异构体）。
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得益于环形IMS仪器的特殊几何结构，约130的IM分辨率足够在RT-DT分析空间中成功表征11种肽。对于单修饰肽，结合b离子和y离子数据成功定位了八种肽中五种肽的修饰位点。对于两种双修饰肽，成功鉴别出了序列中修饰所在的氨基酸位点。
N端修饰和涉及D/L型异天冬氨酸的修饰较难表征，天冬氨酸/异天冬氨酸的鉴别可借助ETD/ECD来解决。
对于残基数量多于6个的肽以及多电荷肽态的分析方法及可靠性还有待考察。本研究中未观察到分析的肽呈现多种构象。分子量更大的肽很可能存在多种构象，Cyclic IMS可以执行更高分辨率的分离（通过次数n>4）和多IMS实验（即母离子淌度分离 — 碎裂 — 子离子淌度分离），有望用于深度解析肽结构（需要同时考虑实验时长与LC的兼容性）。
图6. Post IMS ECD可实现同分异构体的分离和鉴定
在新型蛋白类似物设计过程中，基于LC和高分辨率IM-MS的直接测序工作流程能更快给出反馈信息，加快生物蛋白的开发周期。利用基于环形IM的QToF仪器对CID产生的肽子离子进行IM分离，成功准确定位了异构修饰位点。该方法可实现自动化，用于建立大型修饰肽数据库。通过进一步研究证明该方法的稳定性，在鉴别由生产和化学降解以及合理的肽设计引入的异构修饰和相同分子量的修饰时，使用此方法可以显著加快分析速度，为生物制药研究节省大量时间。
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参考文献///
Jia, C.; Lietz, C. B.; Yu, Q.; Li, L. Site-Specific Characterization of d-Amino Acid Containing Peptide Epimers by Ion Mobility Spectrometry. Anal. Chem. 2014, 86, 2972−2981.
Nick T, Kevin G, Keith R, Jakub U, Martin P, Peter Kresten N, Kim F. H*. Anal. Chem. 2021, 93, 49, 16379 – 16384.
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