26色免疫分型panel是为安捷伦NovoCyte Penteon流式细胞仪设计和优化的，用来鉴定和表征健康C57BL/6小鼠不同组织中的白细胞亚群。
结果应用NovoExpress软件（V1.5.6）进行二维图分析，应用FlowJo软件 (v10.8.1)进行⾼维分析（t-SNE、UMAP v3.1和FlowSOM v3.0.18）。
抗体滴定
图1. 26色方案的抗体滴定。 所有抗体滴定七个浓度，起始浓度范围为1-4 μL抗体每100 μL染色体积，使用C57BL/6小鼠的脾细胞。最佳浓度的选择基于染色指数（即最大或接近最大染色指数的最低抗体浓度），并用红框表示。
手动圈门策略
图 2. 小鼠脾脏免疫细胞亚群鉴定分析的手动圈门逻辑。所有白细胞亚群都可以通过手动圈门准确地区分，在一管样品中可以准确区分T 细胞、B 细胞、NK 细胞、NKT 细胞、单核细胞、巨噬细胞、DCs、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞。
不同组织间分群对比
图 3. 骨髓、血液、淋巴结和脾脏中免疫细胞FACS 图的比较。分析样品时使用与图2中脾细胞相同的手动画门策略。并展示了骨髓、血液、淋巴结和脾脏的主要细胞亚群的画门，以便进行直接比较。
高维分析
图4. 高维分析。 在去除碎片和粘连细胞之后，将每个组织样本中live+CD45+门中的细胞减少到50,000个事件并合并成一个文件，然后将除了CD45和活/死染料以外的所有标记分别进行UMAP，t-SNE和FlowSOM分析。（A）UMAP、t-SNE和FlowSOM分析：（ⅰ）UMAP图。（ⅱ）UMAP与手动圈门细胞亚群的叠加。（ⅲ）UMAP与FlowSOM子集的叠加。（ⅳ）t-SNE图。（ⅴ） t-SNE与手动圈门细胞亚群的叠加。（vi） t-SNE与FlowSOM子集的叠加。（B）对live+CD45+细胞进行t-SNE分析：（ⅶ）骨髓，（ⅷ）血液，（ⅸ）淋巴结和（ⅹ）脾脏。
不同白细胞亚群在不同组织之间的分布比例
图5. 比较不同组织中各细胞亚群的占比。堆叠柱状图代表手动画门的CD4+ naïve、CD4+ EM 和 CD4+ CM，CD8+ naïve，CD8+ EM和CD8+ CM，B细胞，NK细胞，NKT细胞，cDCs，pDCs，单核细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的比例，如图2和图3所示。
FMO对照
图 6.在方案检测时选择部分marker设置FMO对照。表面marker的背景染色可以通过使用 FMO 对照来验证圈门的正确性。图中显示的是完全染色样品和相对应FMO的图，并且圈门与图2中的一致，用以确认圈门是否正确。
结 论
· 26色方案可以准确区分小鼠不同组织中的白细胞亚群。
· 本实验中使用安捷伦NovoCyte Penteon流式细胞仪可以保证同时在单管中分析多达26种标记物，为检测低表达抗原提供更好的分辨率。
· 安捷伦NovoCyte Penteon流式细胞仪为研究人员提供了更多的选择，可以轻松完成高度复杂的多色流式细胞术方案，以解决他们的生物学问题。
参考文献
[1] DusoswaS.A., VerhoeffJ., Garcia-Vallejo. J.J. OMIP-054: Broad Immune Phenotyping of Innate and Adaptive Leukocytes in the Brain, Spleen, and Bone Marrow of an Orthotopic Murine Glioblastoma Model by Mass Cytometry. Cytometry A. 2019 Apr;95(4):422-426.
[2] Mapping leucocyte populations in mouse lymphoid tissues and blood. Application Note.
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