(图片来源:包图网)
磷酸、醋酸以及液相分析中常用到的酸(常见的还比如甲酸,三氟乙酸等),他们的主要区别和选择在于:
各自的酸性不同
磷酸的酸性比醋酸强,就是说,磷酸可以把流动相的pH值调到更低。
紫外本底
有些酸有紫外本底,如甲酸,乙酸;有些没有,如磷酸。这样,在使用较低波长检测的方法时,就要考虑使用紫外本底小的酸。冰醋酸在短波长检测下应该慎用。
挥发性
有些酸是挥发性酸,如甲酸,乙酸,三氟乙酸等;有些不挥发,如磷酸。使用不挥发酸,流动相的pH相对稳定,而挥发性酸可能随时间造成流动相pH缓慢改变。但是,不挥发酸的不挥发性,限制了它们在液质联用时候的使用。
离子强度
酸的离子强度不同,离子强度在很多情況下影响被分析物的解离和性质,造成保留和峰型的改变,通常离子强度为: 三氟乙酸>磷酸>甲酸>乙酸。离子强度很高的酸,通常会对液质联用产生强烈的抑制,如三氟乙酸,几乎可以让负模式扫描信号全部被抑制。
实例:甘草酸铵含量测定液相色谱分析,结构式:
1
方案一
使用初始方法浓度36.5%醋酸进行柱子筛选:
1)条件为:甲醇:醋酸:水=78:0.3:22,柱温30,流速1mL/min,
Ultimate® LP-C18 (4.6*250mm,5μm),效果图:
序号保留时间
峰面积
相对
峰面积
塔板数
分离度
不对称度1
11.54
0.15
2.92
41312
1.81
0.99
2
12.22
5.21
97.08
8531
n.a.
1.16
总和_
5.36
100.00
49843.00
1.81
_
分析:此条件下基本分离,但杂质靠近主峰。
2)改变流动相比例为甲醇:醋酸:水=75:0.3:25,柱温30,流速1mL/min,Ultimate® LP-C18(4.6*250mm,5μm),效果图:
序号保留时间
峰面积
相对
峰面积
塔板数
分离度
不对称度1
13.44
0.03
0.74
6769
1.79
0.86
2
14.49
3.89
76.95
11753
2.28
1.27
3
15.72
0.11
2.20
13355
2.79
1.09
4
13.37
1.07
20.12
11716
n.a.
1.04
总和_
5.05
100.00
43593.00
6.86
_
分析: 主峰包含杂质峰,分离度降低。
3)保持原流动相比例,改变柱温为25度,效果图:
分析:此条件下分离度>1.5,杂质距离主峰较远。
4)使用同款色谱柱重现,效果图:
分析:柱间分离情况及保留时间有差异。
2
方案二
1)使用浓度99.5%的冰醋酸,条件为:甲醇:冰醋酸:水=78:0.3:22,柱温40,流速1mL/min,筛选最优柱子月旭Topsil® C18(4.6*250mm, 5μm),效果图:
序号保留时间
峰面积
相对
峰面积
塔板数
分离度
不对称度1
8.26
0.06
1.05
16441
1.81
0.90
2
8.79
4.85
75.45
10950
1.26
0.93
3
9.17
0.17
2.70
18898
3.50
1.27
4
10.39
1.33
20.80
9349
n.a.
0.83
总和_
6.43
100.00
55639.00
6.57
_
分析:此条件下分离度仍不够。
2)改变流动相比例为甲醇:冰醋酸:水=72:0.3:28,柱温40,流速1mL/min,Topsil® C18(4.6*250mm,5μm),效果图:
序号保留时间
峰面积
相对
峰面积
塔板数
分离度
不对称度1
12.08
0.28
4.37
14875
1.36
0.90
2
12.67
5.15
78.42
10959
2.31
1.10
3
13.78
0.12
1.91
13579
3.75
1.06
4
15.72
1.00
15.29
12282
n.a.
1.04
总和_
6.576
100.00
51695.00
7.42
_
3)改变柱温为30,流动相比例为甲醇:冰醋酸:水=72:0.3:28,流速1mL/min,Topsil® C18(4.6*250mm,5μm),效果图:
序号保留时间
峰面积
相对
峰面积
塔板数
分离度
不对称度1
13.81
0.43
6.30
11392
1.90
1.02
2
14.84
5.30
76.77
10658
1.99
1.15
3
15.94
0.11
1.67
14283
4.44
1.14
4
18.76
1.05
15.26
10337
n.a.
1.09
总和_
6.90
100.00
46670.00
8.32
_
序号保留时间
峰面积
相对
峰面积
塔板数
分离度
不对称度1
14.85
3.85
100.00
10419
n.a.
1.12
总和_
3.85
100.00
10419.00
n.a.
_
分析:分离度>1.5,达到要求。
4)多针重现,效果图:
分析:保留时间较小差异,分离度良好。
结论:使用36.5%醋酸的流动相体系时,在合格的色谱柱条件下,选择4支重现,保留时间差异大。可从以下角度分析:
1)该物质本身就是一个两性离子,有弱酸和弱碱离子,在此条件下,流动相本身的缓冲作用很有限。
2)流动相的pH在4-5之间,这时候在反相C18中硅羟基的解离状态是最活跃的时候(硅羟基的pKa在4.2至4.5之间),物质对填料状态以及柱子之间的差异很敏感,体现在用不同支的色谱柱差异大。在检测甘草及其制品中的该物质时,均出现过这样的现象。
3)醋酸属挥发性酸,在使用36.5%乙酸和99.5%冰乙酸时,等量的变化在两种流动相体系中的影响程度不同,引起色谱结果差异性不同。
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