(图片来源:包图网)
在反相色谱中,流动相的选择原则是:
非极性/中性化合物分析一般用有机溶剂和水。极性(特别是离子型)化合物分析时,通常需要在水中加入酸/碱或者缓冲盐来调整流动相pH值以获得对称的峰形和合理的保留时间。
向流动相中加入改性剂主要有以下两种方式:
01 氢离子抑制法
● 对于弱酸(3≤pka≤7)/弱碱(7≤pka≤8)组分,一般通过调节流动相的pH来抑制目标化合物的解离,以达到分离目的。弱酸的反相色谱保留值随流动相pH值的减小而增大,当pH值远小于弱酸的pka值(pH<pka-2)时,弱酸99%以上以分子形式存在,有利于在反相色谱柱上保留。
● 对于弱碱,情况相反(须pH>pka+2)。因此分析弱酸样品时,通常在流动相中加入少量酸性缓冲液,如三氟乙酸等(实例见图1);分析弱碱样品时,则加入少量碱性缓冲液,如三乙胺等。
● 下表列出几种常见缓冲盐的pH值可用范围。一般缓冲盐浓度在5-50mmol/L范围就够用,浓度高的缓冲盐(>50mmol/L)虽然缓冲能力增强,但可能在与高比例有机相混合时析出,对液相色谱输液泵等产生不利影响。
(图片来源:包图网)
液相色谱中常用缓冲液
缓冲液组成
缓冲液
pka值
缓冲范围
pH值
UV截至波长
三氟乙酸
>2
1.5-2.5
210nm
(0.1%)
磷酸/磷酸二氢钾
或磷酸氢二钾
2.1
<3.1
<200nm
(0.1%)
7.2
12.3
6.2-8.2
11.3-13.3
<200nm
(10mmol/L)
柠檬酸/
柠檬酸三钾
3.1
4.7
5.4
2.1-6.4
230nm
(10mmol/L)
甲酸/甲酸钾
3.8
2.8-4.8
210nm
(10mmol/L)
乙酸/乙酸钾
4.8
3.8-5.8
210nm
(10mmol/L)
碳酸氢钾/
碳酸钾
6.4
10.3
5.4-7.4
9.3-11.3
<200nm
(10mmol/L)
氯化铵/氨
9.2
9.2-10.2
200nm
(10mmol/L)
1-甲基哌啶盐酸盐/1-甲基哌啶
10.1
9.1-11.1
215nm
(10mmol/L)
三乙胺盐酸盐/
三乙胺
11.0
10.0-12.0
<200nm
(10mmol/L)
图1 多种有机酸分离色谱图
(流动相中含磷酸盐)
1-草酸;2-酒石酸;3-奎宁酸;4-甲酸;
5-丙酮酸;6-苹果酸;7-抗坏血酸;8-乳酸;
9-乙酸;10-马来酸;11-柠檬酸;12-富马酸;
13-顺乌头酸;14-丙烯酸;15-丙酸;16-柠康酸
02 离子对色谱法
● 对于强酸/碱及其他离子型化合物,需要在水中加入相应的“对/反离子”,使其与待测组分离子结合生成弱极性的离子对化合物(中性缔合物),以增加其在反相色谱柱(如C18、C8)上的保留,从而改善分离效果。
● 离子对试剂一般可分为酸性和碱性两大类:
1)分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐(实例见图2),如己烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、十二烷基磺酸钠等。
2)分离多羧基、磺酸基等酸性物质常用四丁基季铵盐,如四丁基溴化铵、四丁基氯化铵等。被测组分保留时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值等都有关。
图2 水溶性维生素分离色谱图
(流动相中含己烷磺酸钠)
1-维生素C;2-维生素B3;3-维生素B6;
4-叶酸;5-维生素B2;6-维生素B1
作者:裴海洋
排版:赵林
审核:夏微微
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