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液相方法一
（GB 5009.86-2016）
色谱柱：Athena C18-WP 4.6 × 250 mm, 5 μm(PN：LAEQ-462572)
流动相：A相：0.05M磷酸二氢钾含0.0025M十六烷基三甲基溴化铵（pH:2.5-2.8）
B相：甲醇
A:B=98:2
柱温：25℃
流速：0.7ml/min
进样量：20μl
检测器：二极管阵列检测器，245nm
从谱图看出，按照GB 5009.86-2016中液相方法，采用Athena C18-WP色谱柱，L(-)抗坏血酸与 D(+)异抗坏血酸未能实现完全分离，遇到这种问题，接下来我们是不是要尝试不同品牌或者型号的C18色谱柱？No, No, No，我们有更简单的解决办法，那就是通过调整流动相来进行优化。
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液相方法二
（优化方法）
色谱柱：Athena C18-WP 4.6 × 250 mm, 5 μm(PN：LAEQ-462572)
流动相：A相：0.01M磷酸二氢钾（磷酸调pH至2.5-2.8）
B相：甲醇
柱温：30℃
流速：0.5ml/min
进样量：20μl
检测器：二极管阵列检测器，245nm
还是采用Athena C18-WP同一支色谱柱，只需改变流动相，并对比不同比例流动相（水相/有机相 95/5，97/3，100/0）条件下L(-)抗坏血酸与D(+)异抗坏血酸的分离度，随着水相比例的升高，由于保留因子k的增大，分离度R逐步增大，从1.91提高至2.22，再提高至3.18，都可以实现目标物的基线分离。
结论
采用Athena C18-WP 4.6 × 250 mm, 5 μm色谱柱，优化流动相条件后，流动相更简单（不用添加十六烷基三甲基溴化铵离子对试剂，加快平衡时间），并且可以实现L(-)抗坏血酸与 D(+)异抗坏血酸的基线分离；
优化的流动相，随着流动相中水相比例的增加，L(-)抗坏血酸与 D(+)异抗坏血酸的分离度也随之增大，但考虑到长期使用纯缓冲盐做流动相，会对色谱柱的使用寿命有一定影响，所以建议选择 0.01M 磷酸二氢钾：甲醇=95:5 为流动相，满足分离度的前提下，延长色谱柱的使用寿命。
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