众所周知，合成具有支链的多肽是非常具有挑战性的，此次我们将为您展示一个具有多个支链多肽的合成过程；Biotage创新的Branches功能，可将复杂的支链多肽合成变得简单快速。
Figure 1. Branched peptide 1 and Branches™ representation of 1.
概要：
支链肽的研究正变得越来越热门1，有很多重要的多肽都具有分支结构，例如多聚抗原肽，其已经在多肽-疫苗体系的开发中得到应用2，3；又如细胞渗透支链肽，可以结合RNA4和自组装肽纤维，用于新型多肽模板的开发和研究5。
此篇文章中，我们通过预先设定好的独家Branches功能，在赖氨酸的模板上，对以下具有多个支链的多肽分子进行了全自动合成。
Figure 2. Biotage ® 10 ml reactor vial used in the synthesis.
试剂部分：
所有的试剂耗材以及原材料由以下服务商提供：
Sigma-Aldrich：乙腈，甲酸，三乙基硅烷 (TES)，联氨，以及二氯甲烷(DCM)；
Iris Biotech GmbH ：Fmoc-氨基酸，Boc-氨基酸，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，N-甲基吡咯烷酮(NMP)，缩合剂HBTU，N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)，三氟乙酸(TFA)，哌啶以及N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)；
Rapp Polymere GmbH：TentaGel Rink Amide 合成树脂；
Milli-Q (Millipore) ：默克密理博纯水，用于LC-MS检测；
N-9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)氨基酸包含以下侧链保护基团：tert-butyl(Asp, Glu, Thr, Ser)，2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl(Pbf, for Arg) and 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl (Dde, forLys)。
合成和分析
该多肽分子是由Biotage Alstra 全自动多肽合成仪通过Fmoc固相合成所得。反应瓶规格为10mL，所使用的TentaGelRink Amide 合成树脂的载样量为0.18mmol/g，合成量为0.1mmol。
支链肽1在赖氨酸模板上进行合成，通过与Dde保护基团的侧链位置ε-氨基缩合形成多肽支链。
Nα-Fmoc的去保护直接在室温下进行，此步骤分为两个阶段：1. piperidine/DMF(2:3)的条件下震荡3min，piperidine/DMF(1:4)的条件下震荡15min；之后树脂通过以下步骤清洗：NMP(三次),DCM (一次),以及DMF(一次)。
将6.2当量的氨基酸，6.2当量的HOAt，6当量的HBTU以及11.1当量的DIEA在NMP中与合成树脂进行偶联反应，反应时间为10min，反应温度设定为75℃；反应结束后，树脂回通过以下步骤进行清洗：NMP(三次),DCM (一次),以及DMF(一次)。
整个肽链合成结束后，DCM清洗四次，彻底干燥，之后将样品溶于TFA-H2O-TES (95:3:2)的溶剂体系中，将多肽分子从树脂中切断，用冷乙醚将多肽沉淀出来。
最后通过LC-MS对合成的多肽分子进行分析检测，所使用仪器型号为Dionex Ultimate 3000，分析色谱柱为：Biotage® Resolux™ 300 Å C18（5 μm, 150 × 4.6 mm），分析流速：1.0mL/min，流动相组成：溶剂A—水（含有0.1%甲酸），溶剂B—乙腈（含有0.1%甲酸）；所使用的梯度方法为：5%- 70% 溶剂B。
结果和讨论：
全新的Branches功能为多肽支链的合成提供了一个快速高效全自动的合成方案，简化了实验流程，提高了实验速度，同时产品纯度也有相应提升。
此次支链肽(‘ALSTRA-FASTPEPTIDES’)的合成是在赖氨酸模板上进行的，通过与Dde保护基团的侧链位置ε-氨基缩合形成多肽支链(Scheme 1)。值得注意的是，Fmoc-Lys(Dde)-OH与2个当量的氨基酸、2个当量的HOAt、1.9当量的HBTU以及3.6当量的DIEA，75℃条件下，反应10min即可偶联成功， 伴随着微波加热的高效率，反应的原料使用量也只有原来的1/3，提高了合成效率，降低了成本。
1%的联氨DMF溶液即可将Dde保护基团去除，同时这种条件也可以去除F-moc保护基团，所以在氨基端的Pro和Phe残基，我们选择Boc基团来保护。此次合成过程是完全自动化的，同时我们建立了以下合成顺序：首先Fmoc-Lys(Dde)-OH被固定在树脂上，然后将具有如下序列（Pro-Glu-Pro-Thr-Ile-Asp-Glu-Ser）的多肽支链和具有Boc保护的Pro氨基端形成偶联，之后通过1%联氨DMF溶液可将连在Lys羧基上的Dde基团移除，为保证Dde被彻底移除，反应会继续持续250min。然后将第一个支链（Phe-Ala-Ser-Thr(‘FAST’)）链接到主链上，还是通过同样的方法在Boc保护的氨基端进行偶联；完成后，使用以上相同的方法移除Dde基团，最后将第三条支链Ala-Leu-Ser-Thr-Arg-Ala(‘ALSTRA’)链接到主链上。
Figure 3. RP-HPLC chromatogram and ESI-MS of the branched peptide 1.
整个合成结束后，将树脂清洗切断后得到最终产物，LC-MS分析后得到相关图谱（如下），纯度为78%，得到以下相关离子峰：C93H154N26O32：2148.13
m/z: 1074.9 [M+2H]2+，717.1[M+3H]3+。
结论：
此次我们为您演示了一个复杂的具有多个支链多肽分子(‘ALSTRA-FAST-PEPTIDES’)的合成过程，通常情况下，此类多肽分子的合成是非常具有挑战性的，同时操作复杂，费时费力。而此次通过Alstra Branches功能将此类合成完成的非常简单和快速，此外最终得到的产品纯度也是令人满意的。
参考文献：
1. Pini, A.;Falciani, C; Bracci, L., Curr. ProteinPept. Sci. 2009, 10, 194–5.
2. Tam, J. P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85,5409–5413.
3. Fujita, Y;Taguchi, H., Chem. Cent. J. 2011, 5,48–55.
4. Bryson, D.I., Zhang, W.; McLendon, P. M.; Reineke, T. M.; Santos, W. L., ACS Chem. Biol. 2012, 7, 210–217.
5. Ryadnov, M.G.; Woolfson, D. N., Angew. Chem. Int.Ed. 2003, 42, 3021–3023.
致谢
Prof. Knud J. Jensen and Dr. Kasper Kildegaard Sørensen atthe University of Copenhagen.
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