线粒体结构检测和功能分析

赛默飞生命科学

2023.7.18

作者赛默飞生命科学

TA的动态

线粒体是所有真核细胞中都有的细胞器，核心功能是通过氧化磷酸化作用和脂质氧化反应产生能量。由于是ATP的产地，线粒体也被成为“细胞发电厂”。

除了生产能量之外，线粒体还在细胞信号传导、细胞周期、钙流、细胞生长和死亡中发挥着关键作用。现有研究显示，线粒体功能障碍以及细胞生物能量的破坏与最常见的疾病密切相关，例如II 型糖尿病、心血管疾病、代谢类疾病、癌症和阿尔茨海默病（1）。

因此，无论是在基础研究还是药物研发中，分析线粒体的结构和功能都有着极为广泛的应用。

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线粒体结构标记

根据样品类型和具体应用，线粒体结构标记汇总如下：

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MitoTracker 标记探针

MitoTracker 探针是小分子 (<1 kDa)、细胞渗透性线粒体选择性染料，含有硫醇反应性氯甲基，部分探针可在固定后保持染料与线粒体结合。由于探针与线粒体硫醇形成共价键，因此它们只能用作终点测定，以检测活细胞的线粒体膜电位，不能随时间动态检测线粒体膜变化。

CellLight荧光融合蛋白

当需要在活细胞中不依赖于膜电位标记线粒体并跟踪细胞的行为动态时，推荐使用 CellLight 试剂，操作简单、可与其他试剂共用，也可以固定。

线粒体蛋白抗体

线粒体标记抗体特异性检测线粒体蛋白，可以帮助研究线粒体的形态和动力学以及其他相关的生理病理状态。常见的线粒体靶点有细胞色素C氧化酶（COX），氢离子转运ATP酶线粒体F1复合体，热休克蛋白60，抗增殖蛋白Prohibitin等。

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线粒体功能分析

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线粒体的损伤包括线粒体氧化还原电位和膜电位的变化，后者是线粒体健康的一个核心特征。

线粒体内膜电位对Ca²⁺的吸收和储存、活性氧的产生和解毒作用至关重要，其中最重要的是氧化磷酸化合成ATP（2）。

因此，膜的去极化是评价线粒体功能障碍的良好指标，这与药物毒性的相关性越来越高（3-7）。

膜电位的变化，以及ATP与ADP比率的降低、线粒体基质钙水平的增加、氧化应激和胞质细胞色素c的释放均被认为与线粒体膜通透性转换有关，线粒体膜通透性转换孔(MPTP)可以改变离子和小分子的稳态。

线粒体功能的破坏可以使用各种荧光试剂盒来检测，包括线粒体钙、超氧化物、线粒体膜通透性转换和膜电位的检测。

线粒体膜电位动态变化的检测

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线粒体膜电位的终点检测

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线粒体超氧化物生成的检测

细胞超氧化物生成的增加与多种疾病状态有关（8）。它是氧化磷酸化的副产物，因此提供了另一种评估线粒体健康和细胞状态的方法。

线粒体钙离子检测

线粒体Ca²⁺浓度升高在启动程序性细胞死亡（凋亡）以及其他细胞水平的过程中起着重要作用（9）。荧光探针在结合Ca²⁺时表现出光谱响应，使研究人员能够使用荧光显微镜、流式细胞分析和荧光光谱法研究细胞内游离Ca²⁺浓度的变化。

线粒体膜通透性转换孔变化的检测

线粒体膜通透性转换孔(MPTP)是位于线粒体内外膜的非特异性通道，研究表示，参与细胞死亡过程中线粒体成分的释放。MPTP的开关极大地改变了线粒体的渗透性以及线粒体膜电位。这种持续孔隙激活是由线粒体Ca²⁺超载、线粒体谷胱甘肽氧化、线粒体活性氧水平升高和其他促凋亡条件引起的。

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参考文献

1) San-Millán, I. (2023). The Key Role of Mitochondrial Function in Health and Disease. Antioxidants, 12(4), 782. https://doi.org/10.3390/antiox12040782

2) Nicholls, DG (2004) Mitochondrial Membrane Potential and Aging. Aging Cell 3: 35-40.

3) Tirmenstein, MA, Hu, CX, Gales TL, et al.(2002) Effects of Troglitazone on HepG2 Viability and Mitochondrial Function Toxicol. Sci.69: 131-8.

4) O''Brien PJ, Irwin W, Diaz D, et al.(2006) High Concordance of Drug-Induced Human Hepatotoxicity With in Vitro Cytotoxicity Measured in a Novel Cell-Based Model Using High Content Screening. Arch Toxicol 80: 580-604.

5) Dykens JA, Will Y. (2007) The Significance of Mitochondrial Toxicity Testing in Drug Development. Drug Discovery Today 12:777-85.

6) Dykens JA，Jamieson JD，Marroquin LD，et al .(2008) In Vitro Assessment of Mitochondrial Dysfunction and Cytotoxicity of Nefazodone, Trazodone, and Buspirone. Toxicol Sci 103: 335-45.

7) Abraham VC, Towne DL, Waring JF, et al.(2008) Application of a High-Content Multiparameter Cytotoxicity Assay to Prioritize Compounds Based on Toxicity Potential in Humans. J Biomol Screen 13: 527-37.

8) He L, He T, Farrar S et al.(2017) Antioxidants Maintain Cellular Redox Homeostasis by Elimination of Reactive Oxygen Species. Cell Physiol Biochem 44: 532-553.

9) Giorgi C, Romagnoli A, Pinton P et al.(2008) Ca2+ Signaling, Mitochondria and Cell Death. Curr Mol Med 8: 119-130.

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