反相色谱纯化主要依赖于填料末端烷基链与被纯化分子之间的疏水作用，从而产生了不同的极性和保留时间，而对于填料本身而言，比表面积以及孔径大小也至关重要，孔径大小往往决定了填料的载样量和样品分离度。
本文我们将尝试探索填料孔径是如何影响多肽在Flash纯化的分离效果。
在HPLC的领域当中，色谱柱的孔径的大小以及分布的不同会产生出多样的分离效果，同时已经有非常充足的实验数据帮助用户来选择具体规格的HPLC色谱柱。而对于Flash中低压纯化而言，这方面的讨论却非常稀少，得益于新产品（孔径为300Å 的SNAP Bio色谱柱）的推出，我们将对这一方面进行测试和探讨。
Biotage相继推出了SNAP Ultra C18 (孔径为90Å)和SNAP Bio C18 (孔径为300Å) 的两种C18填料，于是在现有资源的基础上，我们将对这两种规格的C18色谱柱进行对比测试。而对于这种特定的对比试验来说，样品来源的单一性对于实验数据的准确性至关重要，恰巧我们刚刚完成了ACP（65-74）的大规模合成，因此我们选用了同一批次的ACP（65-74）粗品进行研究和分析。通过LC-MS测定，可以确定样品的纯度大约在36%左右，大部分杂质为残留的保护基团。LC-MS谱图见Figure 1。
Figure 1: ACP粗品LC-MS纯度谱图。
首先，我选择了50mg的粗品，用12g的Biotage® SNAP UltraC18色谱柱进行分离，分离梯度进行了适当的优化，见Figure 2。
Figure2: 50mg ACP溶于300 uLDMSO当中，使用12 g Biotage® SNAP UltraC18 色谱柱进行分离；使用水和乙腈作为梯度溶剂，从10%到40%走10柱体积（CV）。
在MS检测和紫外进行收集的条件下，将第4到第6管的馏分进行合并（中间黄色信号峰），通过Biotage® V-10 Touch进行蒸发浓度，得到产物，之后我们将此次纯化后的样品在进行一次纯度检测（Figure 3），得到的纯度大约为77%，结果并不理想。
Figure 3: 使用Biotage® SNAP Ultra C18 色谱柱纯化后的LC-MS分析谱图
随后，我们将色谱柱进行更换，使用Biotage® SNAPBio C18系列色谱柱，它的孔径会更大（300Å），也是将同一批次的50mg粗品进行Flash纯化。见Figure 4。
Figure4: 50mg ACP溶于300 uLDMSO当中，使用12 g Biotage®SNAP Bio C18 色谱柱进行分离；使用水和乙腈作为梯度溶剂，从10%到40%走10柱体积（CV）。
可以看到，和之前分离图谱相比，产物峰部分多了一个肩峰，说明其中的杂质被有效的分离了；在MS检测和紫外进行收集的条件下，将第4和第5管的馏分进行合并（中间黄色信号峰），通过Biotage® V-10 Touch进行蒸发浓度，得到产物，之后我们将此次纯化后的样品在进行一次纯度检测（Figure 5），得到的纯度大约为92%，比上次的分离结果有了明显的改善！
Figure 5: 使用Biotage® SNAP Bio C18 色谱柱纯化后的LC-MS分析谱图
为了进一步佐证实验数据的真实和有效，我们将第一次用10g Biotage®SNAP Ultra C18色谱柱分离后的馏分（纯度为77%）重新注射到Biotage® SNAP Bio C18色谱柱中进行分离。
此次的分离再一次清楚的显示了产物之前的肩峰，说明Bio系列更加适合此类多肽分子的分离。
Figure 6:第二次使用Biotage® SNAP Bio C18 色谱柱对粗品ACP进行Flash分离。
第二次分离之后，我们对样品进行再一次分析，样品的纯度从起始的77%提升到93%！见Figure 7。
Figure7: 使用Biotage® SNAP Bio C18色谱柱纯化后的LC-MS分析谱图
实验结果表明，产物纯度的巨大提升表明是源于填料孔径的变化，而并非硅胶填充量的变化，更大的孔径保证了大分子化合物可以更加充分的进入到固定相孔隙的内部，保证了目标分子和C18链最大程度的接触和相互作用。
很显然，在此次实验中，较大的孔径填料会更容易得到纯度更高的多肽产物。而对于分子量更大的多肽样品而言，我相信这样的规律同样适用，不过我们仍然需要更多的实验数据和讨论。
在多肽纯化过程中，关于固定相的孔径选择，您有什么经验吗？欢迎和我们交流和讨论。
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