对于合成化学的初级纯化而言，其目的是将产品尽可能多的拿到，同时保证纯度在85%或者90%以上即可，作为合成过程的中间体，继续投料到下一步，一步一步反应后，最终得到目标产物。目前市场上应用最广场的仍然是以正相硅胶为主导的分离，意味着大多数的Flash纯化方法开发都是通过TLC点板数据推导出来的。然而当样品不适合用正相进行分离时，往往反相可以发挥作用，不过TLC无法帮助反相体系进行方向开发，这时候可以借助于HPLC等工具进行分析后，再进行分离方法的设置和探索，然后直接的HPLC数据转换往往不一定能得到最有效的分离——即可以保证最大的上样量以及最快的分离速度；因此我们在之前的文章中，推荐过使用相同填料的HPLC分析柱进行方法开发的方案，
由于填料相同，选择性一致，因此最终分离的成功率可以得到很大的提升。
对于一次成功的分离，任何会存在很多的变数需要我们去考量的：
固定相选择性
样品在流动相的溶解性能
产物和杂质之间的选择性差异
组分产物的保留时间
方法梯度长度-时间
方法梯度斜率
此次文章，我将梯度方法斜率和上样量进行测试，看看方法斜率的设置是如何影响上样量的，从而也为您后期的方法建立提供一些新的思路。
首先我们选用了以下通过Biotage Initiator+微波合成仪进行合成的混合样品，用12g Biotage® Sfär C18色谱柱进行测试。
图 1. 马尿酸与苄胺在乙腈中的微波合成。
反应很迅速，十分钟就可以得到产物。
随后我们将产物通过25-75% 乙腈/水（10CV）的方法进行分离，得到了包含产物峰的五个信号峰，如图2。
图 2. 样品分离谱图，信号峰4为产物。
对于反相方法，我们习惯于使用起始5%的梯度比例进行优化，我们可以通过增大或者降低梯度方法斜率的方式来优化产物和杂质之间的选择性和分离度。
作为分辨样品分离难以程度的指标，分离度的高低也决定了上样量的大小，为优化分离度，您可以改变选择性，色谱柱的柱效以及方法的斜率等。
对于反相而言，可以通过改变流动相来改变选择性，不过这个这样的改变有时候奏效，有时候却并没有任何效果。另外改变到一个更小粒径填料的色谱柱也可以增加柱效，从而扩大分离度。
有时候改变梯度斜率，不仅可以改变选择性，同时由于分配系数动力的改变，分离度也会有所变化。
因此我们将通过不同斜率的方法的尝试，展示不同结果的分离谱图。具体所用方法如下表：
起始梯度%B 结束梯度 %B Δ (%) 长度 (CV) 斜率 (%B/CV)
25 75 50 10 5.00
40 90 50 10 5.00
50 100 50 10 5.00
40 65 25 10 2.50
40 50 10 10 1.00
50 75 25 10 2.50
Table 1. 梯度斜率优化方法表
从以下谱图可以发现，40-50%的梯度条件可以提供最高的分离度和选择性，同时也可以将上样量提升到最大，和其他条件相比，40-50%的梯度更加平缓，同时得到的产物与副产物之间的分离度也是最大的。下图3为各种梯度方法下的各种不同的分离谱图，所有样品的上样量均为16mg，同时都是通过溶解在DMSO中后进行直接的湿法上样。
图 3. 不同梯度方法下的色谱分离谱图
Start End Δ(%) Slope V0 V1 V2 V3 w1 w2 w3 Rs (1, Prod) Rs (Prod, 2)
25 75 50 5.00 22.65 101 150 168 16 20 11 2.72 1.16
40 90 50 5.00 21.90 57.5 102 119 15 22 12 2.41 1.00
50 100 50 5.00 21.95 40 62 78 12 20 12 1.41 0.97
40 65 25 2.50 21.75 56. 105 131 15 24 13.5 2.51 1.36
40 50 10 1.00 21.75 55.5 121 164 15 23 17 3.45 2.15
50 75 25 2.50 21.60 38.2 60 79 12 22 12 1.28 1.12
Table 2. 不同斜率方法下的产物和杂质之间的分离度
分离度由两个产物峰（目标产物和杂质）洗脱体积之差(峰顶)除以每个峰宽度之和计算而来。公式如下：
Rs = 2(V2-V1)/(W1+W2)
由于分离度的增加，相应的载样量也可以随之增大，随后我们将分离量加大至80mg，得到如下分离谱图：
图 4. 放大后80mg样品分离谱图。
可以发现放大后，目标产物和杂质仍然存着在很明显的分离。相对于初始的16mg样品，此次分离，我们完成了5倍的放大分离。可以发现，如果没有前期的梯度斜率方法的摸索，此后的放大量纯化则无从谈起。因此当遇到样品分离度不满意时，改变梯度斜率是一个最为简便和快捷的方法。对于一般样品而言，往往比较陡峭的梯度，其上样量得不到保障；而当斜率降低时，往往能够保证比较大的上样量。
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