沃应用 | 新型反相色谱柱BioResolve如何鉴定ADC药物

在生物制药这股市场热潮的推动下，众多制药公司纷纷推出了自己的大分子研发平台。

小编今天想跟大家分享一个沃特世总部与世界著名制药公司之一的合作案例，关于如何通过研制更适合于蛋白和亚基的色谱柱，来鉴定抗体和ADC药物，并为ADC药物建立质量控制方法。

在ADC药物的质量控制标准中，最重要的就是建立载药量（DAR）的分析方法，该制药公司选择了以IdeS酶解片段为检测对象的方案，通过检测含药片段的相对比例对DAR值进行确定。

按照常规的实验经验，采用了C₄进行了方法优化，并对市面上的不同品牌进行了对比，相对满意的结果如下所示：

这个方案中，大多数片段的分离结果还是比较满意的，但是LC(1)及Fd’(1a)两个载药片段与相邻峰没有基线分离，而这会影响方法的稳定性（这很重要！），对于转到QC是很不利的。于是我们把BioResolve这款新型反相色谱柱列入了合作计划，最终的色谱图变成了下面的风格：

从上图可以看到，经过研发人员的优化，所有关键峰都得到了基线分离。而且特别方便的是，这个方法里用的是常规的乙腈-水体系，而不是其他厂家推荐的IPA三元流动相，大大节省了平台方法开发需要的时间。

接下来，客户考虑把这个方法转到QC。以未载药原抗为参比，对比载药前后各亚基（Fd’，LC，scFc）的相对比例，评估了方法的回收率：

从上图可以看出，两者数据非常接近，符合QC方法要求。

鉴于蛋白易吸附的特性，为了确保方法重现性，残留的考察还是要做的。于是我们对甲酸/TFA体系同时做了对比，发现BioResolve的残留在不同品牌中是最低的，甚至可以忽略不计。

方法建立之后，接下来就需要进行LCMS鉴定数据。众所周知，LCMS鉴定时大家常用甲酸体系，以得到最大的灵敏度，鉴定更多的片段，但这样的代价就是会损失峰容量（分离度）。我们在考察峰容量的实验中发现，影响峰容量最大的因素其实是孔径： 

从上图可以看到，在甲酸体系中，由于蛋白的构型发生了改变，需要更大的孔径才能得到与TFA体系同样的分离性能。经过严密的数据对比，我们把最终孔径设定在450Å（提醒一下：受检测方法的影响，不同厂家的真实孔径其实是有差别的哦）。

从上图可以看到，甲酸体系的信号明显增强了，原来微量的两个峰甚至都达到了定量标准，而峰容量（注意看半峰宽）没有明显下降。

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