与动物细胞相比，叶绿体和细胞壁是植物细胞中特有的细胞器，植物细胞能通过叶绿体来进行光合作用，通过细胞壁来抵御病原菌的侵染。但是这些结构的存在给植物学家的科研工作带来了巨大挑战。
例如细胞壁的存在，使得很多荧光染料和探针能以渗透到细胞内部进行标记，因此植物学家更倾向于利用去除细胞壁后的原生质体（图1）来进行荧光标记。但是由于原生质体和植株中的细胞状态差别很大，因此在植株水平进行科学研究仍然是必不可少的。
图1、拟南芥植株（左图）和去除细胞壁后的原生质体（右图）。
由于细胞壁、叶绿体遍布于整个植株，其广泛存在的自发荧光（图2）使得植物学家在对植株水平进行研究时，染料选择变得很受局限，同时很容易与人工标记的荧光信号发生串扰，导致观察到假象，并产生误判。
图2、通过徕卡SP8 X白激光采集的无任何人工标记的拟南芥叶片的激发与发射全光谱数据
从图中可看出，叶绿素和细胞壁会产生很强的自发荧光
白激光Lightgate技术
徕卡专利的混合型HyD检测器和脉冲式白激光的组合使得共聚焦能进行时间门控成像，即Lightgate技术。白激光除了能从470nm-670nm自由调节激发波长以外，同时也是脉冲激光，脉冲频率为80MHz，因此每个脉冲之间具有12.5ns的时间间隔，HyD的时间检测窗口可在0-12.0ns之间进行任意调节（图3）。当我们把检测时间窗口延后，即可把短荧光寿命的信号排除掉，只获取长荧光寿命的信号。而众所周知，细胞壁和叶绿素的荧光寿命是处于皮秒级别的[1]。 
图3、脉冲式的白激光结合高灵敏度检测器HyD可实现Lightgate时间门控技术
我们采用了GFP标记线粒体的拟南芥植株叶片进行了测试，Lightgate能很好地去除保卫细胞中细胞壁的自发荧光以及封片时残留气泡导致的杂散光干扰（图4和图5）。
图4、通过Lightgate去除植物保卫细胞中的细胞壁自发荧光。
上图为非Lightgate成像，下图为Lightgate成像。红绿分别为GFP标记的线粒体和叶绿体的自发荧光。图中箭头所指为细胞壁的自发荧光。
图5、在三维成像中应用Lightgate去植物叶片封片中的气泡杂散光信号及细胞壁自发荧光干扰。
红绿分别为GFP标记的线粒体和叶绿体的自发荧光。左图中箭头所指为封片中残留的气泡导致的杂散光信号和细胞壁的自发荧光。Lightgate可应用于三维光学切片和时间序列等多种成像模式下。
Lightgate在荧光成像中去除叶绿体自发荧光的影响
为了检测Lightgate在荧光成像中去除叶绿体自发荧光的影响，Kodama Y.使用配备白激光和HyD检测器的Leica TCS SP8 X对M. polymorpha植株中的荧光标记进行了对比鉴定[2]。Lightgate能很好地去除叶绿素在黄色和绿色波段的自发荧光干扰（图6），仅需延后0.1ns即可在绿色波段去除绝大部分自发荧光的串扰（图7）。
图6、Lightgate能去除叶绿素在黄色和绿色波段的自发荧光干扰[2]
图7、Lightgate检测起始时间对去除自发荧光程度的影响[2]。仅需延后0.1ns开始门控检测，即可去除绝大部分自发荧光信号
由于总的检测时间窗口缩小，打开Lightgate时间门控之后，人工标记荧光的亮度会稍微有所下降，但是下降幅度很小（图8）。由于使用了高灵敏度的HyD检测器，Lightgate门控导致的亮度下降对正常成像几乎完全没有影响。
图8、打开Lightgate时间门控对在根细胞中Citrine黄色荧光信号的影响[2]
自发荧光的干扰成为植物学成像的一大瓶颈，使得对生理状态下的组织和细胞内的物质追踪等应用变得异常困难。在各种去除自发荧光的各种方法中，徕卡白激光的Lightgate时间门控技术是目前最快捷而有效的一种方法，在去除自发荧光和杂散光的同时，又能保存下绝大部分真实的荧光信号，同时可应用于z-stack、时间序列等各种成像方式中，使得在植株水平进行多色荧光多维成像变得更加轻松自如。
实验材料
本文中图1-图5中使用的拟南芥（Arabidopsis thalinana）材料为绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）定位在线粒体β-ATPase亚基上的43A9株系14天幼苗，材料由中山大学生命科学学院姚楠实验室提供，特此感谢！
参考文献
1. Krause GH, Weis E. Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: the basics. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol Biol. 1991; 42:313–349.
2. Kodama Y. Time Gating of Chloroplast Autofluorescence Allows Clearer Fluorescence Imaging In Planta. Abraham T, ed. PLoS ONE. 2016;11(3):e0152484. doi:10.1371/journal.pone.0152484.
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