显微镜小课堂 | 怎么选择合适的荧光显微镜

荧光显微镜是实验室及病理科标配显微成像设备，利用荧光特性进行观察、成像，广泛应用于细胞生物学、神经生物学、植物学、微生物学、病理学、遗传学等各领域。荧光成像具有高灵敏度和高特异性的优点，非常适合进行特定蛋白、细胞器等在组织及细胞中分布的观察，共定位和相互作用的研究，离子浓度变化等生命动态过程的追踪等等。

荧光显微镜主要分为三大类：正置荧光显微镜（适合切片）、倒置荧光显微镜（适合活细胞，兼顾切片）、体视荧光显微镜（适合较大标本，如植物、斑马鱼（成体/胚胎）、青鳉、小鼠/大鼠器官等）。

滤块的选择除考虑荧光探针的激发、发射波长，对于多色标记样品还需考虑是否有非特异激发、是否串色。在实验中，我们会尽可能选择与激发峰最接近的波长进行激发，而接收范围需包括发峰。如Alexa Fluor 488的激发峰为500nm，在荧光显微镜中可以选择480/40的激发滤片。荧光显微镜常用荧光滤块可分为长通（long pass，简称LP）和带通（band pass，简称BP）两种类型，也需要根据需要进行选择。

目前常用的荧光光源有汞灯、金属卤化物灯，以及近年来飞速发展的LED光源。荧光光源的光谱有连续的和非连续的，在不同波段能量也会不同。LED光源因为其相对较窄的光谱带、更稳定的能量输出、超长的寿命、更安全环保等诸多优点，正逐步成为荧光显微镜的主要光源。

在传统荧光显微镜观察中，由于荧光标记物质和自发荧光结构重叠，使其紧密地结合在一起，而传统的落射荧光显微镜物镜，不但收集来自焦平面的光线，而且还收集焦平面上下的散射光线，结果大大降低了图像的分辨率和对比度。

共聚焦成像仅检测反射自焦平面的光线部分，从而解决上述问题。光源通过一个针孔使在焦平面上形成一个小而精细的光点，从焦平面上发射出的光线通过物镜收集，绝大部分物镜焦平面上面或下面点发射的荧光不能会聚到小孔，只有位于焦平面的荧光以及一小部分离焦荧光能够通过小孔，而焦平面外的光束会聚于针孔板前或后，被阻挡不能通过针孔进入探测器。探测到的图像就是来自焦平面的图像，所以最终的图像质量大大提高。

由于激光扫描共聚焦显微镜的功能具有多种优越性和实用性，因此，当前在高精尖的细胞生物学、植物学以及细胞研究领域中，共聚焦显微镜是不可或缺的实验助手，同时，在未来科学研究中心，它将是最为基础和核心的科研工具。