徕卡课堂 | 自发荧光干扰强，时间门控来帮忙

从图1及图2可见，植物自发荧光的发光波段几乎涵盖了整个可见光范围，与众多荧光染料/蛋白的发射谱相重叠，因此将极大干扰人工标记的荧光信号的成像。此外自发荧光的激发谱也相对较宽，使得区分自发荧光信号和荧光染料/蛋白信号更为复杂和困难。

图1 紫外光激发条件下不同植物成分的自发荧光[1]

图2 拟南芥花粉、叶、根内皮层、木质部的自发荧光[2]

目前去除自发荧光干扰的常规方式是进行序列扫描或光谱扫描，前者对于激发谱和发射谱重叠同时存在的情况无能为力，而后者对于复杂的植物自发荧光也无法完全去除，可以说对于植物自发荧光的去除已成为传统激光共聚焦显微成像的瓶颈。

不同种类的荧光除了光谱参数不同，还存在荧光寿命上的差异，如自发荧光的荧光寿命通常较短，不同的荧光染料/蛋白也具有各自特征性的荧光寿命(表1及表2)。因此，可以考虑从时间维度对荧光信号进行分离，从而去除自发荧光的干扰。

表1 Alexa Fluor系列荧光染料的荧光寿命[3]

表2 常见荧光蛋白的荧光寿命[4]

全新的徕卡SP8 X白激光LightGate时间门控技术，可从时间维度完全去除自发荧光、反射光和杂散光等信号的干扰，使得在体成像的荧光图像具有更好的信噪比和更高的可信度。

白激光为脉冲激光，激发光调节范围470-670nm，激发谱线可以1nm步进自由调节，最多可同时使用8个激发波长。徕卡HyD混合型检测器具有灵敏度高、背景噪音低、动态范围大、读取速度快等特性。HyD与白激光结合，即可实现时间门控(gating)成像，在白激光的两个激发脉冲之间，HyD检测器的时间窗口自由可调，从而从时间维度来避开自发荧光、激光反射光和杂散光等信号的干扰，无需进行序列扫描或者光谱扫描，只需在软件上将Gating打开，调节检测时间窗口即可(图3)。

图3 徕卡白激光和HyD相结合实现的LightGate时间门控技术原理示意图

用时间门控去除植物叶绿体自发荧光

植物用以进行光合作用的细胞器——叶绿体，含有叶绿素和类胡萝卜素等色素，有着极强的红色自发荧光，发射峰值680nm左右，自发荧光的主要来源是叶绿素。在外源性荧光染料/蛋白的成像实验中，叶绿体自发荧光是不受欢迎的背景信号。叶绿体的荧光寿命在皮秒水平，因此可用时间门控实时将其去除。

图4b和4d分别为不使用和使用时间门控时的黄色波段(520-561nm)图像，HyD检测时间窗口为0.0-12.0ns时，514nm激发的叶绿体自发荧光减少17%，时间窗口调到0.3-12.0ns时，自发荧光完全被去除(图4d、图4g)，也就是说，在正常生理条件下没有自发荧光[5]。

b黄色波段(520-561nm)图像；c 红色波段(648-709nm)图像；d 使用时间门控(0.3-12.0ns)的黄色波段(520-561nm)图像；e 明场图像；b-e 标尺10μm；g 时间门控荧光成像技术在黄色波段的效果

图4 地钱叶绿体的自发荧光及门控去除

用时间门控去除植物细胞壁自发荧光

植物细胞壁的主要组成成分是纤维素，它形成细胞壁的框架，在一些成熟和加厚的细胞壁中，常沉积木质素。而纤维素和木质素在绿色波段都有较强的自发荧光，所以在保卫细胞的腹侧能观察到很强的绿色自发荧光信号(图5a)。植物细胞壁的自发荧光寿命相对较短，延后0.3ns即可完全去除，而在0.3ns之前GFP发射出的光子数量极少，此时对GFP的信号强度几乎没有影响。

图5 拟南芥叶片保卫细胞共聚焦成像

a为非时间门控成像；d为时间门控成像，检测时间窗0.3-12ns；b、e为叶绿体荧光；c、f为红绿叠加图像。图中箭头所指为保卫细胞腹侧的细胞壁自发荧光。绿色为GFP标记的线粒体，红色为叶绿体自发荧光。

用时间门控去除植物叶片表面反射光

植物叶片表面通常会分泌一层蜡质，具有防止叶片中水分过多地蒸腾及微生物侵袭叶肉细胞的功能。在用共聚焦对植物叶片成像时，这一层表面光滑的蜡质会导致很强的激光反射光干扰(图6a)。激光反射光在时间维度上与激光脉冲同时出现，所以通过HyD延后0.1ns开始收集信号，即可把激光反射光信号完全去除，使得GFP标记的线粒体结构成像更加清晰(图6b)。

图6 拟南芥叶片表皮细胞共聚焦成像

a. 非时间门控成像，箭头所指为叶片表面蜡质的反射光信号；

b．时间门控成像，gating范围0.1-12ns，箭头所指为GFP标记的线粒体。

用时间门控去除气泡导致的杂散光信号

制样过程中的缺陷和瑕疵也会导致背景杂散光信号的干扰以及荧光图像质量的下降。植物叶片的表皮细胞凹凸不平，在压片时，很难把叶片与盖玻片之间的气泡完全挤出，残留其中的气泡在荧光成像时会导致很强的杂散光信号干扰。通过三维成像，我们可以清晰地看出杂散光信号呈现出的气泡形态，旁边的保卫细胞腹侧也有很强的细胞壁自发荧光信号(图7a)。

通过时间门控延迟0.3ns开始采集图像，细胞壁的自发荧光和气泡的杂散光信号一同被完全去除，但对于线粒体GFP信号无任何影响(图7b)。因此，进行活体组织成像时，结合时间门控技术，能获得信噪比更好的三维重构图像。

图7 拟南芥叶片三维重构图像

a为非时间门控成像；b为时间门控成像，gating范围0.3-12ns。图中箭头所指为保卫细胞腹侧的细胞壁自发荧光，三角形所指为气泡导致的杂散光。绿色为GFP标记的线粒体，红色为叶绿体自发荧光。

自发荧光的干扰在组织成像中普遍存在，在各种去除自发荧光的各种方法中，LightGate时间门控技术是目前最快捷最有效的一种方法，同时可以应用于三维层切、时间序列等各种成像模式，使得在体荧光动态多维追踪变得更加轻松。

实验材料与成像方法

本实验中使用的拟南芥(Arabidopsis thalinana)材料为绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)定位在线粒体β-ATPase亚基上的43A9株系14天幼苗(材料由中山大学生命科学学院姚楠实验室提供)。

我们使用HCX PL APO CS2 100× (NA 1.4)油镜，在激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP8 X)下使用HyD混合型检测器对43A9株系叶片表皮和保卫细胞进行了荧光成像，绿色和红色通道均采用488nm激发，反射光检测范围分别为500-550nm和653-790nm。

参考文献

1. Talamond, P, Verdeil, J-L, Conéjéro, G. Secondary Metabolite Localization by Autofluorescence in Living Plant Cells. Molecules. 2015, 20(3), 5024-5037.

2. Berg, RH. Evaluation of spectral imaging for plant cell analysis. J. Microsc. 2004, 214, 174–181.

3. Thermo Fisher Scientific. The Molecular ProbesTM Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and labeling Technologies. 2010, 11th Edition: Chapter 1.

4. Seefeldt B, Kasper R, Seidel T, Tinnefeld P, Dietz K-J, Heilemann M, Sauer M. Fluorescent proteins for single-molecule fluorescence applications. J. Biophotonics 2008,1(1),74-82.

5. Kodama Y. Time Gating of Chloroplast Autofluorescence Allows Clearer Fluorescence Imaging In Planta. PLoS ONE. 2016, 11(3), e0152484