辉瑞制药最新PNAS文章：定量Western blot研究蛋白水解靶向嵌合分子(PROTACs)机制

蛋白水解靶向嵌合分子(Proteolysis targeting chimeras,PROTACs)是双功能小分子化合物，同时结合靶蛋白和E3泛素化连接酶，通过泛素化使得靶蛋白降解。PROTACs是一种可以不依赖酶解作用及信号通路活化，实现蛋白调节的新机制。最近几年，PROTACs成为一种有吸引力的机制，来探索以前“无药可选undruggable”的靶点。

尽管很有吸引力，但是确定药物选择性(selectivity)和药物可达到的活性强度(achieving potency)等参数依旧是一个挑战，

辉瑞全球药物开发部多个研究中心，2018年7月31日在著名期刊美国科学院院刊（PNAS）上发表文章，Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK，PNAS July 31, 2018. 115 (31) E7285-E7292; published ahead of print July 16, 2018.

文章主要使用了ProteinSimple 定量western blot系统Wes，研究11 PROTAC化合物的文库（11-compound PROTAC ）对 Bruton’s tyrosine kinase (BTK)的有效降解。

主要结果 

1.     11化合物库

2.    细胞系研究结果

人淋巴瘤细胞系Ramos，化合物时间依赖及剂量依赖关系研究

U型剂量依赖关系形成是因为过高剂量化合物会竞争形成二元化合物{BTK–PROTAC} and {PROTAC–CRBN}，但是降解需要形成三元化合物{BTK–PROTAC–CRBN}。

进一步使用BTK-ligand和CRBN-ligand同时阻断PROTAC和BTK及CRBN的结合，可以完全阻断BTK降解，单独阻断BTK及CRBN效果不明显。

进一步洗脱实验证实BTK降解是因为PROTAC的存在导致的

3.   实验动物大鼠研究结果

对于大鼠脾脏细胞BTK具有选择性降解，但对于来源于肺脏的BTK无作用。显示出化合物的组织选择性，后续会进一步研究组织选择性的机制及可能带来的药物使用方向。

4.   药物药效研究是非常严谨的科学，通过化学发光信号值直接定量，可以精准的揭示药物的有效性。ProteinSimple的Wes Simple western系统是可以直接输出化学发光信号值进行定量的定量western Blot技术。如下图：使用化学发光信号值(Chemiluminescence)研究剂量依赖的动态变化。

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