电子激发裂解(EED)分析聚糖序列

复合物中聚糖在各种生理和病理过程中起着重要作用，如胚胎形成、宿主-病原体相互作用、炎症和肿瘤发生。在制药工业中，糖基化是决定重组单克隆抗体治疗药物的溶解性、稳定性、有效性和免疫原性的关键因素。 

了解聚糖的不同功能需要测定许多结构变化，包括序列、分支模式、连接和立体化学构型，电子活化解离（ExD）是近年发展起来的一种用于聚糖分析的方法。研究发现能量超过前体离子电离电势的电子辐照产生了新的裂解途径，即电子激发离解（EED）可以提供丰富的MS/MS碎片信息。同时，具有新算法的生物信息学软件，被用于分析复杂的EED谱图和建立聚糖结构信息库。

本方法的整合工作流程将EED与聚糖的HPLC分离和谱图自动解析结合，对聚糖结构进行全面表征。 将2ug聚糖样品氘代还原和全甲基化，采用静态纳喷雾或HPLC进样导入样品，在布鲁克12T solariX磁共振质谱MRMS上分析EED谱图。GlycoDeNovo软件用于聚糖结构自动解析。

图1显示了LNFPV糖苷的CID和EED MS/MS碎裂图。尽管可以根据CID谱中系列Y离子推算出该聚糖的序列，但由于缺少交叉环碎片，而无法测定连接结构。相反，EED产生了许多连接诊断交叉环和次级碎片。例如，1,3A2α和C2α/Z3α离子的存在表明非还原端的Gal1→3GlcNAc的连接，而Z1β•-CHDOCH3特征离子的出现表明还原端Fuc1→3Glc的连接。对于含有异构结构的聚糖混合物，使用MRMS EED-MS/MS与RPLC连接，用于聚糖异构体的分离和表征。 

从头开始的聚糖测序要求在每个糖苷连接位点存在至少一个糖苷片段或序列离子。鉴定出所有序列离子就可以推算聚糖的结构。本EED谱图自动解析使用了一种改进的评分算法，根据前后峰来估计峰归属的准确性。对给定的一组标准聚糖的EED谱，软件鉴定出每种类型碎片的特征前后峰，根据前后峰计算峰正确归属的可能性。再通过所有辅助峰的累加离子分类器分数对候选结构进行排序。

本应用显示EED可以比CID产生更丰富的结构信息来解析聚糖序列和连接方式。目前，只能在MRMS仪器上能够进行聚糖序列的EED分析，其高质量分辨率和质量精度对于峰的精确解析是至关重要的。本工作流程为复杂的聚糖样品的快速表征提供了一个强有力的工具。