多肽研发背景简介
近几年，多肽分子由于其独特的结构性质，集合了化学药物和蛋白药物的优点，稳定性又好于蛋白药物，生物活性高、特异性较强，免疫原性较弱等，成为21世纪最有发展前途的药物之一，然而多肽药物的合成、纯化、生产一直都面临很大的挑战，多肽分子的合成路径的设计、纯化方案的摸索、生产工艺的开发一直都是药物化学家需要花费巨大的人力物力财力去突破的方向，为解决以上相关难题，Biotage开发出了一种通过自动化操作对整个多肽研发进行全流程服务的方案，该方案专门为从事多肽药物研究的化学家们以及该领域的新人而服务。
由于多肽分子拥有丰富多样的空间结构，且易于合成，常见氨基酸的成本也相对低廉，同时和传统化学药物分子相比，拥有较低的毒副作用，因此越来越多的企业和研究所将其作为潜在的药物活性分子进行开发研究。目前大约60种多肽药物已经被FDA批准，140种多肽药物已经进入临床试验阶段，另外，全球大约有超过500种多肽药物正处于前期的研究开发中；截至目前，很多上市的多肽药物正在为人类健康发挥着巨大作用，这其中包括雅培公司用于治疗前列腺癌的利普安Lupron，2011年其全球销售额超过了23亿美金。目前多肽的研究和利用,出现了一个空前的繁荣景象，其热度正处于历史最高水平。
多肽分子在合成和纯化存在的挑战
目前市面上几乎所有的多肽合成方案都是以固相合成为主，通过一步一步的去保护和偶联反应将氨基酸一个一个地嫁接到主体骨架上去，除了20种常见的氨基酸之外，还有很多的特种氨基酸也会被考虑进多肽骨架当中去，所以从结构以及合成过程来说，多肽分子有其规律性的一面，也有其独特性质和结构的一面，随着氨基酸的数目增加之后，其空间结构的变化也会的更加复杂，这也是大分子多肽药物需要克服的问题之一。在开始进行合成之前，合成路径以及方法的摸索往往也极具挑战，需要花费很多的精力摸索；其原因在于往往一个多肽分子拥有几十个以上的不同的氨基酸，另外随着氨基酸的逐步增加，空间位阻以及相关增加的疏水性会使反应越来越困难，增加了后期得到目标产物的难度。
所以，尽管大多数氨基酸的结构都比较简单，但当数量增加之后，其设计以及合成过程往往会变得复杂而富有挑战。
例如下图环状多肽：
图1. 环状多肽案例：肽纳米管类似物
一旦分子被设计之后，传统方法是通过常规搅拌加热的方式进行偶联缩合，在很多的放大生产的实验中，此方法仍旧在发挥作用。然而此类传统方法在现代实验室的多肽研发过程中却相当麻烦和缓慢的，在进行每一步偶联之后，都需要进行反应后处理和制备纯化操作；由于多肽合成的每一步都具有非常高的相似性，甚至只需通过一种去保护和偶联方法即可得到目标产物，于是一种新型高效的合成方案正大受欢迎——固相多肽合成，此方法通过将氨基酸固定于树脂之上，反应后直接进行一步简单的过滤，即可达到纯化效果，快速、简单、方便。再解决的多肽合成的便利和快速之后，多肽合成中，另一个挑战则是如何保证在几十个偶联反应之后，仍有较高的收率。
反应数对最终产物收率的影响
图 2. 三种不同的产率条件下，不同长度的多肽对最终收率的影响。
在进行每一步的多肽合成偶联中，每一步的产率都非常关键，只有将每一步的产率达到最理想的效果，最终产物的纯度才不至于偏低，从而也降低了纯化的难度。在进行相关测试之前，目标多肽的纯度也被严格标定的，因此反应后的纯化制备往往也非常关键，决定了实验的成败。可以发现，多肽分子的长度一定程度上决定了合成以及纯化过程的难易；对于后期测试而言，不同的测试所要求的纯度不尽相同，以下为不同测试对纯度的要求：
测试试验
纯度要求
定量研究，如H谱C谱核磁、单克隆抗体制备、体内试验、受体配体结合研究、酶联免疫吸附测定ELISA和放射免疫分析RIA等。
>95%
高通量筛选，非定量酶底物试验，抗体亲和纯化，免疫组化的非定量阻断 (IHC)或免疫印迹试验
>80%
酶联免疫吸附测定 ELISA标准，酶联免疫斑点测定法ELISPOT分析，多株抗体制备
>70%
表1. 多肽分子测试所需纯度要求
可以发现，不同的测试有不同的要求，因此最终产物的纯度异常重要，在多肽研发的流程中，分子的纯化制备往往是非常耗时耗力也是至关重要的一步。
Biotage提供多肽研究全流程解决方案
一个合理的多肽研发流程应该包括：分子设计，合成，纯化制备，以及样品浓缩，从而得到相应纯度的产物；Biotage已经为整个流程设计了一套全自动多肽研发解决方案，为您的多肽研究插上起飞的翅膀。
专业简洁的独家可视化多肽合成软件，为您的多肽合成提供全自动简明便捷且易于理解的操作，让您对结构和路线一目了然。
在设计理念上，我们秉承质量收率以及时间优先的原则，设计和合成相应目标多肽。
保证目标多肽的纯度从而使其可以通过一种更加快速而便捷的方法进行多肽纯化—Flash 纯化。
纯化后得到最终产物。
下面我们将把Biotage具体的全流程方案通过实例进行具体详尽的介绍。
多肽的概念化以及合成路线设计
多肽的概念化以及相应的合成路线的设计是一个复杂而艰巨的过程，往往在前期做大量的系统研究才能确定一条最佳路线。许多多肽分子从结构上看都比较简单，但是当和去保护以及偶联反应相结合，确定到具体每一步的顺利流程时，特别是遇到环状肽或者支链肽的情况下，合成路线的设计就会变得异常关键。在此条件下，Biotage为您提供了Alstra全自动微波多肽合成系统，您可以通过系统软件设计和编辑合成方法，可视化查看分子结构，灵活好用是我们认为的关键点之一，分子结构的设定，合成路径的设计、编辑，方法的添加和改进，等等都可以通过Biotage可视化的软件实现，另外软件可支持结构复杂多肽分子的可视化，甚至可进行局部的分解视图。实例如下图：
图 3. BiotageInitiator+ AlstraTM 可视化操作软件，可支持局部放大，支链以及环状肽合成
采用质量优先、时间适宜的策略进行目标多肽合成实例
当多肽结构以及合成路线确定后，最关键的合成操作即可上线，Biotage对于多肽的合成策略一直都是质量（纯度/收率）为最重要的参考标准，每一步的偶联都以能得到最高收率为目标，从而保证最终产物拥有最优秀的纯度，因此在每一步的合成过程中，我们设计可多次清洗的操作，以保证能够得到高纯度高质量产物；很多情况下，多肽产物的纯化是多肽研发过程中需要克服的瓶颈，因此在前期合成的过程中，最大程度的保证合成质量和样品纯度就显得非常必要；一方面可减少样品损失，节约成本，另一方面可为后期的纯化提供便利。
Biotage Initiator+Alstra全自动多肽合成仪在设计之初就秉承着这一理念，以合成质量为首要标准，如图4的方法编辑视图中，Alstra在单个偶联反应中设计多次清洗操作，用户也可根据实际情况修改具体方法，默认情况下需要对多肽进行四次清洗，以去除多余的氨基酸、反应溶剂和试剂；从而保证样品的纯度。
图 4. Alstra 系统下，偶联方法编辑试图。
我们进行了实际的合成案例分享，多肽ACP 65-74是一段公认的比较难合成的多肽分子，其序列为：H-VQAAIDYING-NH2，合成方法设定后，我们将Alstra进行了过夜反应，合成结果样品如图5。
图 5. BiotageInitiator+ Alstra 合成的多肽ACP65-74（H-VQAAIDYING-NH2 (MW= 1062)），左：HPLC谱图，纯度：98.7%；右：质谱图；合成量: 0.1 mmol, 树脂: ChemMatrix Rink Amide, 方法条件:单个偶联反应时间 5 min，(DIC/HOBt) at 75 °C。
从上图结果可发现，通过Alstra质量优先策略的合成方案，最终纯度达到了98.7%，当然此种情况下仍可对合成过程进行加速，通过优化反应条件或者减少清洗次数，但是在加速的同时，也会存在失去高纯度产品的可能性。另一方面，还可通过提高反应试剂的浓度来提高反应质量，如Fmoc保护的氨基酸等，浓度越大，反应速率越快，产率也会越高。浓度太低，反应速度容易受到影响；不过如果浓度过高也并非好事，其高粘度反而也会一定程度上影响化学反应的进程。
Biotage Initiator+ Alstra全自动多肽合成仪采用高精度数字注射泵，确保样品的移取不受其浓度影响，保证每一次移取的准确性。下表为不同浓度条件下的所得到的产品纯度对比：
表2. 不同浓度对最终产品纯度的对比
多肽纯化
目前大多数的多肽纯化都是通过反相高压制备HPLC来实现，然后高压制备HPLC也存在着一些缺点，比如耗费时间长，处理量较低，操作复杂且仪器设备昂贵；但遇到此种情况时，Biotage开拓了一种全新的多肽纯化模式——Flash制备纯化，不仅仪器设备成本低，而且纯化速度快，操作也会更加的方便快捷，为您节约大批量的纯化时间，和高压制备相比，Biotage多肽纯化方案往往只需要单次纯化即可取得目标纯度，这一切得益于Biotage为多肽用户独家开发的Bio 系列多肽样品纯化色谱柱，目前拥有C4以及C18两种类型色谱柱，具体规格参数如下表：
表 3. Biotage SNAP Bio 多肽样品纯化柱相关参数
随后我们对色谱柱的性能进行了试验；在纯化之前，我们设计并合成了一种螺旋肽(44-mer)H-KRKKQKRKRKRAKQLRKRLQALEWQLAQIRKELQAAEKEEAQIENH2，得到粗品产物150mg，随后使用25g的SNAP Bio C18多肽色谱柱进行分离，分离谱图如图6；得到纯品后，我们通过HPLC以及质谱对产物进行了结构以及纯度鉴定，纯化后纯度可达97%。
图 6. 螺旋多肽(44-mer)Flash纯化谱图，流动相：乙腈/水，产物峰为图中绿线标记。
图 7. 纯化后样品(44-mer)HPLC纯度以及质谱报告。
以下我们将HPLC和Flash在进行150mg多肽（44-mer）纯化时的参数进行了对比，表格如下：
表 4. HPLC与Flash进行44-mer的参数对比
很明显，和HPLC纯化相比，Flash可以节约很多时间，减少溶剂消耗，由于单次上样代替了多次注射，后期的溶剂处理也会变得异常简单和快速。
多肽样品浓缩
当合成以及相应的纯化操作结束后，纯品仍旧保留在所使用的流动相当中，此时我们需要将溶剂进行蒸发回收，得到纯的不含任何溶剂的固体或者液体样品，由于多肽的分子量都较大，往往最终产物的形态都是以固体为主；那么如何去除流动相呢？传统的方案都是通过旋蒸将流动相旋干，或者冷冻干燥机将样品冻干；但由于多肽的样品都是通过反相柱层析来进行制备纯化，流动相都是水、乙腈、甲醇为主，这些溶剂的沸点都相对较高，传统方法往往需要花费数小时甚至数天时间才能完成样品浓缩；效率低下，且能耗很高。
然后，在Biotage的多肽研发流程方案中，我们可以为您提供一种全新的针对于高沸点溶剂蒸发的解决方案——V-10 Touch高沸点溶剂蒸发工作站；可以为您提供史上最快溶剂蒸发解决方案，为您加快速度，节能减排，V-10 Touch可高效、安全地将无机和有机相溶剂快速蒸干，尤其适用于制备液相收集的馏分以及各种高沸点溶剂的蒸发旋干；V-10在技术上的突破主要是从以下三方面进行体现：
1. 高速旋转的样品瓶可达9000 r/min，使得溶剂形成了10倍于常规旋蒸的最大表面积，大大加速的蒸发，同时避免了汽化中心的生成，避免样品爆沸，造成损失。
2. 蒸发的同时，系统会提供均一的热源，保证蒸发过程一直有能量支撑。
3. 超高真空度，最低可达 2 mbar，大大提高蒸发效率和速度，数分钟内将即可将DMSO和NMP轻松除去！
系统内置多种蒸发方案，也可以进行方法自定义，随时控制蒸发速度和效率，下表为在带有样品的条件下，各类溶剂蒸发时间表。
表 5. 带有样品条件下，不同溶剂蒸发所需时间表
系统可以通过配置多样品转盘，进样泵，Gilson机械臂等实现样品馏分处理的智能全自动过程。
此后我们将刚刚纯化后的多肽样品ACP馏分，通过V-10 Touch进行了浓缩处理，整个过程仅需要5分钟，溶剂量：5mL，溶剂组成：95% TFA; 2.5% TIS; 2.5% H2O，方法温度：35°C
图 8. 多肽样品ACP经过V-10蒸发前后对比。
总结
随着中国医药产业的日益发展和成熟，多肽药物的开发已经成为整个行业的热门议题，而在多肽研究过程中，其合成，制备以及产物浓缩占据着整个研发过程的核心地位，影响着相关项目的开发速度，在此篇文章中，Biotage展示了一套涉及合成，纯化，浓度这三大步骤的多肽研发解决方案，为整个多肽研发体系提供了最新的仪器解决方案，帮助加速多肽研发，减少能源消耗，降低运营成本。
参考文献
1. Peptide therapeutics: current status and future directions, KeldFosgerau Torsten Hoffmann, Drug Discovery Today, volume 20, Issue 1, January2015, Pages 122–128
2. Ghadiri el al. Nature, 1994, 364, 301–304
首页
