【基因组学】经典与传承——二代测序核酸质控篇

安捷伦视界

2017.8.16

作者安捷伦

TA的动态

种瓜得瓜，种豆得豆。二代测序能给出多么完整的结果除了测序平台与试剂外，最重要的就是样本的质量。

近年来，二代测序的应用越来越广泛，有 DNA 靶向捕获测序、RNA 测序、甲基化测序、全外显子组 DNA 测序、全基因组 DNA 测序；二代测序的临床应用也不断拓展，癌症早期筛查、癌症用药指导、遗传病筛查、优生优育。随着二代测序与疾病和健康的关系越来越紧密，对测序质量的要求也越来越高。二代测序流程复杂，中间步骤繁多，时间周期长，价格不菲，且有的样本相对珍贵，因此大家都希望能确保二代测序的实验一次成功。

为此，安捷伦公司自 1999 年便推出了 2100 生物分析仪，用于二代测序各环节的质控，是二代测序质控的鼻祖和金标准，每个二代测序实验室基本都配备一台 2100 生物分析仪。对于 RNA 检测，安捷伦公司还首创了拥有自主知识产权的 RNA 完整性数值“RIN”值，用于评估 RNA 的完整性，是目前 RNA 质量评估的国际公认标准。为适应目前大规模测序的要求，安捷伦公司又于 2015 年推出了通量更高、操作更简便、以及用于评估基因组 DNA 完整性和浓度的 DNA 完整值“DIN”值的 4200 TapeStation 系统。安捷伦 2100 生物分析仪与 4200 TapeStation 系统孜孜不倦地服务各类基于二代测序应用。

今年 4 月份，安捷伦的中国技术专家就“如何做好 NGS 各环节的质控”进行了网络在线直播，详细阐述了二代测序各个环节的质控步骤和对样本的评估方法。

*有兴趣的同学可以点击文末左下角的“阅读原文”观看录播讲座。

2100生物分析仪，经典力作，成就不老的传奇

2100生物分析仪原理

DNA、RNA 和蛋白在强电场条件下能够从负极往正极移动，DNA、RNA 或蛋白样本结合特异的荧光染料后在电场的作用下在 2100 配套的充满了高分子筛聚合物的石英微管芯片中从负极往正极移动。在移动的过程中小片段迁移速度快，大片段迁移速度慢，样本中的核酸分子或蛋白根据分子量的大小，由小到大依次通过检测窗口，根据这些片段通过检测窗口的时间和检测窗口所收集到的荧光信号强度确定 DNA、RNA 和蛋白的片段大小和浓度。

2100 生物分析仪的操作

2100 生物分析仪操作简单，三步即可完成。

2100 生物分析仪的应用

DNA 应用：片段化 DNA 的检测，包括二代测序、杂交、定量 PCR 及芯片等的质控

RNA 应用：RNA 完整性分析，主要用于 RNA 表达谱芯片，RNA 测序等的质控

蛋白应用：通过蛋白分子量大小的变化查看蛋白的糖基化，抗原抗体等的质控

2100生物分析仪配套试剂盒

DNA 试剂盒

根据片段大小不同，分别有检测 25-1000bp，100-7500bp 和 100-12000bp 范围的 DNA1000， DNA7500，DNA12000 试剂盒；针对 50-7000bp 的皮克级高灵敏度 DNA High Sensitivity DNA 试剂盒，适用于二代测序上机测序前文库精确定量。

DNA Assays：

片段大小
浓度定量
PCR 产物，DNA 片段化产品质控
每次检测 11-12 个样本，检测时间 30-45 分钟

RNA 试剂盒

根据检测灵敏度不同，分为纳克级别的 6000 Nano 和皮克级别的 6000Pico，以及专门针对小 RNA 的 Small RNA 试剂盒。

RNA Assays：

总 RNA，mRNA 定量及纯度和完整性分析
检测 Small RNA 浓度和片段大小
每次检测 10 个样本，检测时间 30 min

蛋白试剂盒

根据蛋白的分子量大小，分为 P230，P80 和 HSP250 检测试剂盒。

Protein Assays：

检测蛋白的大小，浓度
能检测纯化后的蛋白，抗体，细胞裂解液等
每次检测 10 个样本，检测时间 40 分钟

2100 生物分析仪提供的检测数据

2100 生物分析仪提供胶图和峰图两种图形显示模式，其中峰图为原始数据形式，胶图则是考虑了用户传统的使用习惯，是由峰图转换而来。除图形格式外，还提供表格形式的结果输出方式。

上图：胶图示意图；下图：峰图示意图

4200 TapeStation 系统，传承经典，攀登实验室自动化的新高度

4200 TapeStation 系统技术原理

同样是基于 DNA、RNA 和蛋白在电场中从负极到正极移动的特性，不同大小 DNA 或 RNA 样本结合上特异的荧光染料后，在电场的作用下在预制的高分子筛胶中实现分离，通过对整个胶条拍照，根据不同片段所处在胶条上的位置及所收集到的荧光信号强度确定 DNA 和 RNA 的片段大小和浓度。

4200 TapeStation 系统的操作

取 1-2µl DNA 或 RNA，加入相应的荧光染料缓冲液，直接将样品板或样品管放到 4200 TapeStation 的样本区，再放上对应的预制胶条，点击Start即可。

4200 TapeStation 系统的应用

适用于 DNA 和 RNA 的质控，以及 DNA 和 RNA 的浓度、片段大小的分析。除与 2100 生物分析仪一样有 RNA 完整值 RINe 值外（RINe 与 2100 生物分析仪的 RIN 有高度的可比性），4200 TapeStation 系统增加了对于 DNA 完整性的评估—— DIN 值，适用于检测全基因组 DNA，包括 FFPE 样本的降解程度，准确评估待测 DNA 的质量。