干货| 核酸质谱实验前处理方法与技巧

（1）使用商品化DNA提取试剂盒，按试剂盒中提供的操作说明书提取样本DNA。样品来源包括血样、组织、细胞、唾液等。

（2）使用超微量紫外分光光度计进行OD值检测，其中 OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.8～2.0，表示DNA较纯；1.25%琼脂糖凝胶电泳检测，单一条带，无明显拖尾降解，表明 DNA完整性较好，质检合格。提取核酸分装后于-20℃储存备用。

根据 260nm 处的吸光值，1OD等于 50ng/μL的dsDNA的计算公式，计算提取核酸的浓度。DNA储存浓度要求50ng/μL最为适宜，实际使用时稀释为5-10ng/μL浓度再进行 PCR扩增反应。

注意：

（1）已提取的DNA须冷冻储藏，使用前解冻，涡旋混匀，但反复冻融不宜超过3次。

（2）待提取DNA的样本可能具有潜在感染力，操作前必须做好防护措施。

2.1 PCR Primer配制

参照 DNA合成报告对应项或管上标签提示，加入适量的缓冲液（TE）或水，稀释单管 PCR 引物至浓度100μM。混合所有单管PCR引物，超纯水补水定容至 PCR引物混合液中每条引物浓度为0.5μM。

如补水体积 V(μL)=混合引物总体积200μL-每条引物1μL×反应重数×2

2.2 MPE Primer配制

（1）参照 DNA合成报告对应项或管上标签提示，加入适量的缓冲液（TE）或水，稀释单管MPE引物至浓度200μM。根据具体引物不同的分子量，按照MPE引物配制表格进行MPE Primer的混合。

（2）MPE Primer在使用前需先上机点靶测试，保证MPE Primer全部出峰， 且低峰高度不低于高峰一半。若达不到此要求需在引物配制时进行微调，如低强度的引物可加大浓度。

注意：

（1）PCR Primer和MPE Primer需存放-20℃，使用时解冻，涡旋混匀，但反 复冻融不宜超过3次。

3.1 PCR反应流程

（1）用户可根据具体实验用量配制 PCR混合液。如果样品个数较多，除 DNA模板外的试剂可以预先混合成PCR mix，考虑到到枪头损耗，PCR mix一般多配10%左右。PCR mix如暂时不用，可放于4℃冰箱，最好不超过8h。

（2）在每个PCR反应管中分装PCR mix 4μL，加入已提取好的DNA模板1μL（共10ng）。轻轻涡旋混匀，1000rpm离心1min。

（3）混匀后按说明书推荐程序进行PCR反应。PCR温控程序见下。

（4）待PCR反应流程结束后，取出样品。待样品管冷却至室温，可进行下步实验。

注意 ：

（1）PCR mix最好现配现用 。

（2）如有需要可将样品管离心后进行下步实验。

3.2 SAP反应流程

(1) 用户可根据具体实验量配制SAP mix。如果样品个数较多可以预先混合成SAP mix，考虑到枪头损耗，SAP mix一般多配10%左右。如暂时不用，可放于4℃冰箱，最好不超过8h。

(2) 在每个PCR反应产物管中加SAP mix 2μL，轻轻涡旋混匀，1000rpm离心 1min。按说明书推荐程序进行SAP反应。SAP温控程序见下。

(3)  待 SAP反应结束后，取出样品。待样品管冷却至室温，可进行下步实验。

注意：

（1）SAP mix最好现配现用。

（2）如有需要可将样品管离心后进行下步实验。

3.3 MPE反应流程

(1) 用户可根据具体实验量配制 MPE mix。如果样品个数较多，可以预先混合成MPE mix，考虑到枪头损耗，MPE mix一般多配10%左右。MPE mix如暂时不用，可放于4℃冰箱，最好不超过 8h。

(2) 在每个SAP反应产物管中加 MPE mix 4μL，轻轻涡旋混匀，1000rpm离心 1min。按说明书推荐程序进行MPE反应。MPE温控程序见下。

注意：MPE mix最好现配现用。

3.4树脂纯化

（1）在每个反应孔中加入 14μL 超纯水。

（2）把装有树脂的八连管轻轻翻转过来扣在样品板上，保证树脂孔与样品的每个孔对齐。然后轻敲树脂管，使树脂落入样本板的孔中。

（3）使用掌式离心机，瞬时离心，避免树脂附着在管壁上。

（4）将带有树脂的样品板放置在翻转混匀仪中，20 rpm混匀 30 min。

（5）混匀结束后，样品 2000 rpm 离心 1 min，上清液待测 。

3.5点样

取出OligoPlate靶板，滴加 0.5~1μL纯化后上清液，自然干燥结晶，待上机（QuanSNP核酸质谱系统）测定。

注意：制备好的靶板须在24 h内进行测试。