除了核酸，qPCR还能玩转蛋白

       全球性新冠疫情的爆发，让以荧光定量PCR（qPCR）为核心的核酸检测技术“出圈了”。殊不知，qPCR除了可以扩增检测核酸外，对蛋白质的研究也有独到之处。

       做蛋白质研究，如何确保蛋白质稳定性是绕不开的课题。蛋白质的稳定性一般取决于和配体的相互作用、缓冲液条件以及构象的变化，要摸索优化这些条件非常耗时费力。如果我们把qPCR的核酸熔解曲线实验原理转移到蛋白质研究中，就可以很方便地在荧光定量PCR仪上通过蛋白质热漂移Thermal shift实验进行蛋白热稳定性的研究，只需把核酸荧光染料换成蛋白质标记常用的SYPRO Orange即可。

        SYPRO Orange荧光染料是一种自然猝灭的染料，蛋白质变性后，它能高效地结合到暴露出来的蛋白质疏水核心，进而发生荧光信号的增强。蛋白质在不同状态下，其熔解温度Tm会有不同，通过比较不同条件下蛋白质Tm值的变化，便可知道蛋白质是否发生变性。该方法操作简单，灵敏度高，反应快速，是拓展荧光定量PCR仪应用的一个新方向。

       我们以一个简单的实验案例来看一下，如何用荧光定量PCR仪检测蛋白质热稳定性。本实验研究的目标蛋白质是溶解在TBS中的α-胰凝乳蛋白酶原A，检测在3种浓度不同的NaCl溶液下，其蛋白Tm值的变化情况。

表1、样品反应体系的配置（20μl /孔，每种NaCl浓度3个复孔）

实验结果：

表2、三种NaCl溶液下的熔解温度Tm值

结论：

       从熔解曲线的结果可以明显看出，随着NaCl溶液浓度的提高，α-胰凝乳蛋白酶原A的热稳定性也随之提高，20 mM时的Tm值为49℃左右，2 M时的Tm值在55℃左右，Tm值大约漂移了6℃。我们还可以进一步探讨引起热稳定性提高的原因，比如说较高的盐浓度可导致α-胰凝乳蛋白酶原A的水化壳的形成，由此提高了蛋白稳定性。

       蛋白质热漂移实验是检测蛋白质热稳定性的简便快速的方法，有助于评估蛋白质配体结合、最佳缓冲液条件或分析蛋白质构象变化等。

       荧光定量PCR仪是开展蛋白质热漂移实验的优选工具。

       1. 高通量：可同时进行96个乃至384个样品的检测。

       2. 检测快速：反应时间只需要十来分钟。

       3. 操作简单：反应体系的配制比qPCR实验还简单，反应程序只需调用熔解曲线。

       4. 低成本：SYPRO Orange是易获得的常规的荧光染料。

        当然，并不是所有荧光定量PCR仪都适合做蛋白质热漂移实验，还需要考虑重要的两个方面：

        1. 仪器上必须要装配有专用于SYPRO Orange的检测通道。

        2. 仪器的温控精准度必须要高，能有效区分开不同情况下蛋白质Tm值的差异。

     德国耶拿公司出品的荧光定量PCR仪qTOWER3系列，能根据客户需求灵活配置检测通道，提供专门的SYPRO Orange蛋白检测通道，温度准确性±0.1℃，温度均一性±0.15℃，中文软件简单直观，是开展蛋白质热漂移实验的理想之选。