diaPASEF：复杂蛋白质组样本的非标定量

布鲁克质谱

2019.11.06

作者布鲁克

TA的动态

基于质谱的定量蛋白质组学已经成为解析蛋白质组动态变化的核心技术。其中，基于DDA（Data-Dependent Acquisition，数据依赖采集）的方法具有优越的灵敏度和选择性，然而由于肽段被选择性碎裂产生MS/MS谱图，母离子的选择具有一定的随机性，在分析大样本队列时会产生多个缺失值。

timsTOF Pro采用双TIMS结构和PASEF（Parallel Accumulation Serial Fragmentation，平行累积连续碎裂）扫描模式，具有更快的扫描速度、更高的灵敏度和更好的离子选择性，为Shotgun蛋白质组学建立了新的标准。CCS（CollisionCross Section，碰撞截面积）的精确测量，为组学数据增加了第四维来进行Match BetweenRuns，部分地补偿了DDA方法中的随机效应并降低了匹配的假阳性。

基于DIA（Data-Independent Acquisition，数据非依赖采集）的方法将整个全扫描范围分为若干个窗口，并循环地对每个窗口中的所有离子进行碎裂和检测，这种方法的缺失值少并且定量准确、变异小，有望在大样本队列中实现可重复和准确的蛋白质组定量。由于timsTOF Pro检测CCS值的高重复性，使得基于4D（保留时间（retention time）、离子淌度（mobility）、质荷比（m/z）、离子强度（intensity））谱图库的匹配更具有吸引力。布鲁克与苏黎世联邦理工学院、德国马普研究所和多伦多大学合作，将PASEF与DIA的优势相结合，产生了一种新的采集模式称为diaPASEF（图1）。

图1. 全新diaPASEF采集策略

在diaPASEF扫描模式中，母离子在进入四级杆之前已经通过淌度进行了累积和分离，根据碰撞截面积（CCS）大小依次洗脱（与m/z有一定相关性），这样四级杆就可以根据洗脱离子的m/z进行离子选择，并且每批PASEF都会有多个窗口进行扫描，从而提高离子的利用率，避免了传统DIA方法中离子利用率低的问题。此外，使用离子淌度和质量数双重隔离窗口来触发MS/MS，提高了母离子选择和匹配的准确性，并降低了二级混合谱图的复杂性。并且在一级热图中，可以选择多电荷区域作为dia-PASEF的母离子窗口，有效屏蔽单电荷杂质的干扰。采用diaPASEF测定200ng HeLa酶解液时，单个2h梯度鉴定了7000多种蛋白质；10ng HeLa酶解液，鉴定到3000多种蛋白质。

为了进一步评价diaPASEF的非标定量能力，我们将HeLa、酵母、大肠杆菌的肽段分别按照65%、30%、5% （HYE-A样本）和65%、15%、20% （HYE-B样本）混合，单针上样量为200ng，采用diaPASEF模式32个窗口的方法进行数据采集，然后通过Spectronaut软件进行数据处理。谱图库采用ddaPASEF的模式采集，共含有13,013个蛋白、136,682个特异性肽段。在假阳性率低于1%的条件下，单针diaPASEF超过8000个蛋白质可以获得可靠的定性及定量结果（图2上），定量值跨越5个数量级，两个样本的蛋白定量CV中位数分别为6.7%和7.2%，肽段定量CV中位数分别为8.1%和8.6%（图2下），并且三次技术重复的相关性平均值为0.99，具有优越的定量稳定性。

图2. HeLa、酵母、大肠杆菌混合样本(HYE-A, HYE-B)的dia-PASEF鉴定量和定量CV分布

在HYE-A和HYE-B样本中，分别对HeLa、酵母、大肠杆菌的蛋白进行定量对比，这三个物种蛋白的ratio分布于1.0、1.9、0.3，接近于理论值1.0、2.0、0.25，并且被清晰地分割开，定量结果可靠、稳定（图3）。

图3. HeLa、酵母、大肠杆菌混合样本(HYE-A, HYE-B)的diaPASEF定量分布

目前，Mobi-DIK、PEAKS、Spectronaut、MaxQuant和Skyline等蛋白质组学软件均支持diaPASEF的数据分析，可实现质量数、保留时间、离子淌度和信号强度的4D特征校准和准确定量。不依赖于图谱库的diaPASEF数据采集方法，以及全新三维靶向PRM（3D-targeted PRM）方法正在开发中。

参考资料

1. Meier, F. et al. Parallel accumulation –serial fragmentation combined with data-independent acquisition (diaPASEF): Bottom-up proteomics with near optimal ion usage. bioRxiv 656207 (2019). doi: https://doi.org/10.1101/656207

2. diaPASEF: label-free quantification ofhighly complex proteomes, 1871458_LCMS-160_ebook （下载请点击文末“阅读原文”）

3. Parallel accumulation - serialfragmentation combined with data-independent acquisition

(diaPASEF), 1869385_LCMS-157_ebook

4. Meier, F. et al. Online parallelaccumulation – serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobilitymass spectrometer. Mol. Cell. Proteomics mcp.TIR118.000900 (2018).doi:10.1101/336743