2019年12月11日，Journal of Clinical Investigation在线发表了香港浸会大学卞兆祥教授、广州中医药大学方晓东教授和贾伟教授团队对腹泻型肠易激综合征的研究论文。三支团队开展了临床、代谢、分子生物学、和生物信息学跨学科合作，通过代谢组学和宏基因组分析，研究了IBS-D队列肠道菌群与胆汁酸紊乱的关系，并确定肠道微生物群是否参与以及如何影响IBS-D的胆汁酸排泄。
以排便不规律为特征的肠易激综合症（IBS）影响全世界10％的人口，其中以腹泻为主的IBS（IBS-D）在西方和亚洲国家发病率更高。粪便胆汁酸已被证明在12％至43％的IBS-D患者中排泄过多。粪便胆汁酸过量被认为是腹泻型肠易激综合症（IBS-D）机制之一。但是，引起胆汁酸过量排泄的原因并不清楚。由于肠道菌群在胆汁酸代谢中的重要性，所以肠道肠道菌群紊乱可能会导致IBS-D中过量的胆汁酸排泄。
IBS-D患者胆汁酸水平变化特点
研究共纳入345名符合ROME IV标准的IBS-D患者，其中共290名患者完成了所有检测并提供本研究所需生物标本。同时，招募了91位年龄和性别匹配的健康受试者，其中89位（HC）提供生物标本。如表1所示。与HC相比，IBS-D组排便频率和粪便总胆汁酸显著增加，但粪便的一致性降低。但在IBS-D和HC组中，粪便总胆汁酸排泄量呈偏态分布（根据Shapiro-Wilk检验，p<0.05）（图1A）。
根据HC组确定的90%位数临界值发现24.5％的IBS-D患者粪便总胆汁酸排泄量过多（≥10.61µmol / g），这些受试者被分为胆汁酸排泄过多（BA+IBS-D）组，粪便总胆汁酸排泄量正常（<10.61µmol / g）的患者被类为BA-IBS-D。与HC和BA-IBS-D组相比，BA+IBS-D患者血清C4水平升高和FGF19水平降低，以及腹泻症状严重性增加。相关分析表明，BA+IBS-D组粪便总胆汁酸水平与血清C4水平和腹泻症状评分（Bristol粪便量表和排便频率）呈正相关，而与血清FGF19水平呈负相关。这些结果表明，IBS-D患者中胆汁酸合成增强，并伴有胆汁酸排泄过量和腹泻症状严重性增加。在BA+IBS-D患者血清和粪便中观察到单个胆汁酸变化规律，但在BA-IBS-D患者中未发现单个胆汁酸差异。血清胆汁酸谱显示以共轭胆汁酸和游离初级胆汁酸占大多数。BA+IBS-D患者GCDCA、GUDCA、CDCA的绝对浓度和相对比例均显着升高。此外，BA+IBS-D患者血清UDCA绝对浓度升高，而GHDCA相对比例降低。与HC组相比，BA+IBS-D患者粪便胆汁酸主要由游离的胆汁酸代谢物组成，其中CA、CDCA、DCA、LCA、7-KDCA、UDCA和ωMCA绝对浓度显着增加。同时，CA、CDCA、UDCA和7-KDCA比例有所增加，而LCA和12-KLCA比例降低。但是，BA-IBS-D组和HC组之间的粪便胆汁酸组成没有差异。血清和粪便胆汁酸谱的结果显示，BA+IBS-D患者源自菌群代谢生成的胆汁酸成分发生了变化，表明参与胆汁酸代谢的菌群可能存在异常。
IBS-D患者肠道菌群变化特点
与HC和BA-IBS-D组相比，BA+IBS-D患者粪便微生物群落显示出更高的Bray-Curtis相异指数，而总基因数和Shannon指数没有差异。这些结果表明受试者微生物丰富度没有变化，但BA+IBS-D组中微生物系统的不稳定性更大。与HC或BA-IBS-D组相比，BA+IBS-D患者粪便微生物分类水平明显不同。具体而言，BA+IBS-D患者中厚壁菌门、放线菌门、梭杆菌门和变形菌门相对丰度明显增加，而拟杆菌门相对丰度降低。厚壁菌门与拟杆菌门比值（F/B）显著升高。在属水平上，几种梭菌属细菌包括瘤胃球菌属、梭菌属、真细菌属和Dorea属丰度增加，双歧杆菌属、大肠埃希氏菌属和嗜胆菌属丰度也出现升高。但是，另枝菌属和拟杆菌丰度降低。BA+IBS-D组菌群组成的变化也与胆汁酸代谢相关基因组的变化有关。另枝菌属和拟杆菌丰度丰度降低与编码胆汁酸去偶联酶胆酰甘氨酸水解酶的基因cgh丰度降低有关。而编码7α-羟基类固醇脱氢酶（7α-HSDH）的基因hdhA丰度升高则归因于大肠埃希氏菌属、梭菌属、瘤胃球菌属、梭菌属物种增加。而且，梭状芽胞杆菌（Clostridium scindens）和未分类的毛螺菌科物种在很大程度上导致了编码7-脱羟基酶的baiCD和baiH基因丰度升高。相关性分析结果显示，梭状芽胞杆菌属（包括梭状芽孢杆菌）丰度与粪便总胆汁酸和血清C4水平呈正相关，但与血清FGF19水平呈负相关。宏基因组学结果明确了BA+IBS-D组梭状芽孢杆菌丰度升高，且胆汁酸解偶联、C7异构体和脱羟基作用的基因组存在差异。这些结果表明富含梭状芽胞杆菌的菌群可能会影响IBS-D患者胆汁酸合成和排泄。
富含梭状芽胞杆菌粪菌移植增强伪GF小鼠胆汁酸合成和排泄
为了研究富含梭状芽胞杆菌的微生物群对胆汁酸代谢的影响，在ABX诱导的伪GF小鼠进行人源粪菌移植。移植一周后，在BA+IBS-D粪菌受体小鼠及其供体之间发现了类似胆汁酸转化菌群特征，其中拟杆菌水平降低，而厚壁菌门、梭状芽孢杆菌簇XIVa（C.XIVa）和梭状芽孢杆菌水平升高。同时，BA+IBS-D粪菌受体小鼠的盲肠菌群显示去结合能力显著降低，7-HSDH和7α-脱羟基水平略有增加。这些结果与BA+IBS-D供体的粪便菌群测定结果一致。同时，BA+IBS-D粪菌受体小鼠表现出与胆汁酸相关的腹泻症状，包括胃肠道蠕动时间缩短和粪便粘稠度降低，与供体症状相似。代谢结果显示，BA+IBS-D粪菌受体小鼠粪便总胆汁酸和血清C4含量增加，以及肝脏和回肠内牛磺酸结合型胆汁酸（TβMCA，TCA，TCCDA和TUDCA）升高。此外，肝mRNA分析结果显示，BA+IBS-D粪菌受体小鼠胆汁酸合成酶CYP7A1和CYP8B1表达升高，同时SHP mRNA表达降低。同样，回肠反馈激素FGF15的mRNA表达显着降低。肝CYP7A1表达增加和回肠FGF15表达降低在蛋白质水平得到证实。肝FGF19受体复合物（FGFR4、KLB）和回肠胆汁酸活性转运蛋白（ASBT、MRP2/3、 OSTα/β）没有变化。这些结果表明，BA+IBS-D供体的富含梭菌的粪菌可以增强受体小鼠的胆汁酸合成与排泄并诱导胆汁酸相关的腹泻样症状，并且这种菌群诱导的作用似乎与回肠胆汁酸转运和肝反馈信号无关。
梭状芽胞杆菌定植增强小鼠肝胆汁酸合成和排泄
为了进一步阐明梭菌属物种对胆汁酸合成和排泄的影响，将梭菌属物种定植于野生型小鼠。与对照组相比，梭状芽孢杆菌(C. scindens，108CFU / mL)定植增加了小鼠盲肠微生物群中C. scindens的丰度。与对照组相比，C. scindens定植小鼠盲肠菌群显示胆汁酸去结合活性略有降低，而7-HSDH活性显著增强。经万古霉素处理的小鼠盲肠菌群显示梭状芽胞杆菌物种丰度显著降低，同时7-HSDH和7-脱羟基酶的体外活性降低。但是，胆汁酸去结合能力显著增强。此外，C. scindens定植降低了粪便稠度，并稍微加快了小鼠胃肠道转运，而万古霉素对梭菌的抑制作用显著减弱小鼠胃肠道的运动。代谢结果显示，C. scindens定植小鼠粪便总胆汁酸和血清C4含量显著增加，而万古霉素诱导的梭状芽胞杆菌缺乏小鼠粪便胆汁酸和血清C4的含量却明显降低。定植小鼠肝脏和回肠腔中牛磺酸结合型胆汁酸（TβMCA，TCA和TUDCA）含量升高，而梭状芽胞杆菌缺乏的小鼠中显著降低。此外，C. scindens导致小鼠肝脏中CYP7A1 mRNA表达升高，但无统计学意义（p<0.08）。然而，万古霉素处理的小鼠肝CYP7A1基因表达显著降低。尽管FXR基因表达组间没有差异，但其介导的反馈调节剂--肝SHP和回肠FGF15在万古霉素处理后其基因表达显著增加。C. scindens定植显著降低FGF15基因的表达，这在蛋白质水平也得到了证实。在各组之间，FGF15受体FGFR4和KLB的表达水平没有差异。这些结果表明，C. scindens定植导致胆汁酸的合成和排泄增加，同时在野生型小鼠中诱导了腹泻表型。用抗生素抑制梭状芽胞杆菌则产生相反结果。C. scindens定植小鼠中胆汁酸变化与BA+IBS-D菌群受体小鼠胆汁酸变化相似。
CYP7A1在万古霉素（10至400 µM）或C. scindens菌株（活菌和热灭活）处理后在肝细胞中表达没有变化，从而排除了它们对肝胆汁酸合成的直接影响。但由于胆汁酸产物对FXR活化具有抑制作用，因此富含梭菌属菌群和梭状芽孢杆菌定植小鼠中检测到的过量胆汁酸（TβMCA，TCA和TCDCA和TUDCA）可能会抑制肠道FXR介导的反馈信号，从而增强肝胆汁酸合成。
梭状芽胞杆菌基于肠道负反馈信号发挥抑制作用
在检测到的优势胆汁酸中，TβMCA已证实具有拮抗FXR作用，因此对其他牛磺酸结合型胆汁酸如TCA、TCCDA、TUDCA及其混合物（T-胆汁酸）在体外和体内对肝和肠FXR反馈途径进行了考察。NCI-H716细胞实验表明，TUDCA和T-胆汁酸会使肠上皮细胞FXR表达稍微减弱，但显著降低FGF19表达。在肝细胞（L02细胞）中，T-胆汁酸诱导FXR表达显著降低。同样，TUDCA和T-胆汁酸可以减少SHP表达，但只有前者显著增强肝细胞CYP7A1表达。采用8周胆汁酸干预（50mg/kg/d）体内试验进一步证实了这些作用。回肠FXR基因表达被TUDCA显著降低，而被TCDCA和T-胆汁酸略微减弱。这三种治疗均可显著降低小鼠回肠FGF15表达，增强肝CYP7A1表达。在小鼠肝脏中，牛磺酸结合型胆汁酸对FXR表达没有影响，而TUDCA增加了SHP表达（图S5B）。这些结果表明，梭状芽胞杆菌来源的胆汁酸（TUDCA和T-胆汁酸）可以减弱肠道FXR/FGF15信号传导，但是它们增强肝FXR/SHP信号传导的影响尚存争议。
初级胆汁酸以及由梭菌参与代谢的次级胆汁酸是否也影响肠道FXR/FGF19信号传导？采用不同的干预方式研究人肠上皮细胞中的FXR和FGF19基因表达情况。CDCA作为FXR最有效的激动剂，可显著增强肠上皮细胞FXR和FGF19表达。CA也可增加FGF19表达。尽管其他胆汁酸（GCDCA、GUDCA、GCA、UDCA和7-KDCA）的单次处理对FXR和FGF19表达没有影响，但这些胆汁酸可以有效拮抗CDCA诱导肠上皮细胞的FXR激活。这些结果表明，梭菌参与代谢的次级胆汁酸可以抑制肠FXR/FGF19信号传导。
小结
尽管本研究在个体之间已经进行了标准化采样，但在纵向研究中仍需要进一步验证富含梭菌的微生物群与胆汁酸合成/排泄增强之间的联系。另外，本研究纳入人群不包括I型和III型BAD患者，因此，微生物群驱动机制是否仅出现在原发性BAD（II型）还需进一步研究。不过本研究通过宏基因组学、代谢组学和分子生物学方法，发现富含梭菌的微生物群可以增强胆汁酸排泄。该机制主要通过FGF19/15水平降低从而导致抑制肝胆汁酸合成的反馈调节机制作用丧失。该研究表明，富含梭状芽胞杆菌的微生物群及合成过量胆汁酸可能是IBS-D更精确诊断和症状管理的生物基础。更广泛地讲，肠道微生物的代谢功能性的评价非常重要，它不仅有助于IBS研究，还可用于所有与肠道微生物群相关的疾病的机制和治疗研究。
参考文献
Zhao L, Yang W, Chen Y, Huang F,et al. A Clostridia-rich microbiota enhances bile acid excretion in diarrhea-predominant irritable bowel syndrome. J Clin Invest. 2019 Dec 9. pii: 130976. doi:10.1172/JCI130976.
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